利用不同的方法筛选和鉴定转化子..docx

利用不同的方法筛选和鉴定转化子摘要:通过使用不同的方法，从大肠杆菌中筛选和鉴定出转入了GFP基因并表达出GFP的菌株。实验先用蓝白斑筛选得到含有载体的转化子，之后用菌落PCR对其中的重组子进行进一步鉴定，最终通过对表达的产物的检测确证是否能表达出GFP。实验结果表明挑选出来的菌株并没有表达出GFP，需要挑选其他菌落继续实验。关键词:蓝白斑筛选、菌落PCR、GFP、蛋白质检测前 言我们采用的是目前应用最广泛、技术最成熟、同时也是最经典的微生物基因重组，作为载体的质粒，我们需要选择或者构建带有多克隆位点和带有抗性基因的质粒，前者有利于基因顺利导入到受体细胞，后者方便我们对转化产物进行筛选；对于受体细胞，我们所选择使用的大肠杆菌，具有遗传背景清楚，结构简单，表达效率高，容易获取等优点，已经建立起一套完善成熟的表达系统，是目前转基因领域最受欢迎、使用最普遍的系统之一。GFP自从发现以来，已经获得了广泛充足的应用，是生物领域的重要材料绿。绿色荧光蛋白本身无毒，且不需要其他辅酶或者反应底物，在紫外或者蓝光激发下就可以自主发光，而且有较好的稳定性，当其基因与其他蛋白质表达基因相融合时，该蛋白质既能保持原有活性，发光能力也不受影响，这意味着我们可以将GFP与我们想要了解的蛋白质相接合在一起，将GFP作为荧光标签，对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等机理进行追踪和观察，因为这种特性，绿色荧光蛋白具有其他报告蛋白无法比拟的优点，已经在生物研究中获得广泛的应用。我们已经通过一系列的实验操作，获取GFP基因，用PCR技术将其扩增并连接到载体质粒pMD19-T Vector上，用CaCl2法将其转入到大肠杆菌中，经过本次实验的筛选和鉴定，构成了完整的转基因操作流程，将我们的课堂学习和实际操作结合起来，从而对转基因技术有一个最直接的认识。尽管在当下中国，转基因技术备受争议，但是每一名生物专业的学生，都应学习了解国际科学社会在转基因领域上所取得的巨大成就，并看到其广泛的应用前景和巨大的市场潜力，同时将所学习到的关于转基因知识科普出去，让每一个公民都能科学、正确地认识转基因，理性、客观地参与到关于转基因的有益讨论中去，推进我国生物科学技术的发展。一、材料、试剂和器具1.材料转化菌液：经过转化操作的E. coli DH5α菌株(R-，M-，Amp-或者含pMD19-T Vector)2.试剂含氨苄青霉素(Amp, 100mg/L)的LB固体培养基、LB液体培养基、X-gal（200mg/ml）储存液、IPTG储存液（20mg/ml）、10×PCR buffer 、rTaq 酶、dNTP mixtures（dATP，dTTP，dGTP，dCTP）、无菌蒸馏水、1.5% 琼脂糖凝胶、矿物油、DNA maker、1×10 Loading Buffer引物溶液(P1、P2各10μM)P1:GFP-F: 5-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3(Tm=65.5℃)(Sal I)P2:GFP-R: 5-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3(Tm=61.5℃) (XbaI)3.器具超净工作台、涂布器、无菌牙签、PCR管、移液枪、移液管、离心机、PCR仪、天秤；灭菌锅；琼脂凝胶电泳系统；紫外照射摄像系统；恒温振荡培养箱；蓝光手电筒二、实验步骤1.蓝白斑筛选筛选培养基的准备在制备好的含100 mg/L Amp的LB平板表面中央位置分别加入40μl X-gal储存液和4μl IPTG储存液，用无菌玻棒将溶液涂布均匀，置于超净工作台上，使培养基表面的液体完全被吸收。1.2菌落筛选培养取500 μl复壮后的转化菌液涂布于筛选培养基表面，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住培养皿边缘，倒置培养皿，37℃培养过夜。1.3结果观察观察平板，是否有蓝色和白色菌落，分别计数，白色菌落即为重组子。2.菌落PCR2.1挑菌选择大小合适，最好周围有蓝斑的白色菌落5个，编好号码之后，小心地刮取一半，分别涂抹于对应的1.5mLPCR管底部。2.2配制PCR反应体系先按下列试剂于PCR管中配制50μL的PCR反应体系总液10 × PCR buffer 5μLdNTP mixture 4μL前向引物 (P1) 2μL反向引物 (P2) 2μLrTaq酶0.5μL灭菌蒸馏水36.5μL所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，然后取10μL分别分装到涂抹有菌落的PCR管中，稍离心后，加入10μL矿物油，2.3 PCR反应PCR仪设置参数如下：94℃2 min94 ℃ 30sec61 ℃ 30sec40 cycles72 ℃ 45sec72 ℃ 5 min2.4琼脂糖凝胶电泳检