制药工艺学..doc

合成生物制药工艺知识点 基础知识 工程生物：通过基因工程、转基因、合成生物学等工程技术创造的生物。例如重组微生物、合成微生物、转基因植物、转基因动物、采用合成生物学思路，以大肠杆菌为底盘，分析表达重组人干扰素工程菌的构建过程。 合成生物学：按照人类的目的设计并创造新的生命元件器件，功能模块乃至自然界不存在的生命系统; 对现有的生命体进行有意义的工程改造，赋予其新的功能。合成生物学研究如何设计和构建人工生命，依靠人工开发的基因密码，按照预定的方式运行生命。 生物元器件 ·基因（生物）元件：具有某种特定的生物学功能的DNA，是设计和合成生物的基本单位。特性：信号接受和输入功能，信号发送和产物输出功能，调节信息流、代谢和生物合成的功能，和其他元件相互作用，具有特定的工作环境。 ·功能元件：编码1个/组生化反应酶功能基因/基因簇；编码组成细胞组分蛋白质的基因 ·界面调控元件:包括功能基因转录、蛋白质翻译与修饰、功能酶反应等的调控基因。 ·生物部件：由一个或多个基因元件组成最简单的能行使催化功能的生物部件是完整的编码酶基因表达盒。 ·生物模块是一组细胞内区域化的生物部件，由内在功能联系在一起，执行特定的复杂功能。如代谢途径、 信号转导途径、调控途径等。模块：通过某种（逻辑/功能）关系把生物元件连接而成。 ·与电子科学中的电路类似，在合成生物学，不同功能的生物砖联接后，能像电路一样运行，形象地称为 基因线路（genetic circuit）。按功能分为:代谢线路,调控线路,信号线路等。 合成生物的设计与优化 Endy D提出了合成生物学设计的工程策略：标准化、解耦联和抽提。标准化：确立基本生物元件的方法、对生物功能的定义和特征描述。解耦联：复杂系统解分成具有独立功能的简单组分。抽提：建立元件和模块的层阶。 1、生物元件的设计与优化 抽提：一个反应对应一个酶，一个酶对应一个基因。功能模式：基因表达调控的操纵子模型。优化：功能基因密码子、启动子、核糖体结合位点。适合于不同宿主表达的生物元件。 2.基因电路的设计与优化 生物砖构建基因电路的困难是，把相同功能的不同生物来源的生物砖集成基因电路后，不一定具有功能。优化方法可以是基于数学模拟的理性设计，也可以是生物元件的直接进化。 5. 合成生物学的研究思路、应用 6.　DNA体外重组 体外重组是把不同来源的DNA分子用特异性酶切割，然后将两者连接成杂合分子。体外重组的两大工具: 核酸限制性内切酶和连接酶，如同剪刀和胶水。 6.1质粒载体　 结构：复制起始点、选择标记、多克隆位点； 特性：自主复制性：复制起始点以及控制复制频率的调控基因。不相容性：具有相同或相似复制子结构及特征的的质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。转移性：从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞。选择标记：抗生素抗性基因等。表达功能：能转录、翻译合成外源基因的产物。 类型：克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。测序质粒：用于基因测序。整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。表达质粒：能表达基因产物。 噬菌粒载体：由丝状噬菌体DNA复制起始位点序列与质粒组成的杂合分子。M13噬菌体间隔区克隆到质粒上，形成噬菌粒。特点：象质粒一样，自主复制而稳定遗传。象噬菌体一样，包装成颗粒，分泌胞外。基因在M13载体和质粒载体之间的转移。激活过程：辅助丝状噬菌体感染带有噬菌粒的受体细胞，反式激活噬菌粒上的间隔区位点，启动噬菌粒以丝状噬菌体DNA的复制模式进行复制。分别包装成颗粒并分泌到受体细胞外。 黏粒载体，考斯质粒 由λ DNA的cos区与质粒DNA重组而成，主要用于基因文库的构建。 6.2限制性核酸内切酶 概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。 种类：I类限制性内切酶：识别位点和切点不同，切断部位不定。II类限制性内切酶：严格识别, 特异性切割。III类限制性内切酶：特异性切割，识别部位和切点不同。 内切酶的识别序列：4、5或6个碱基对，而且具有180°旋转对称的回文结构。有些酶切割后产生平末端,大部分酶切割后产生黏末端，5′或3′突出末端。 .影响酶切的因素：活性单位（1U）定义：为50 μl反应体系中，特定温度下经过1小时反应，完全分解1 μg DNA所需酶量。甲基化：从带有DNA甲基化酶基因的宿主中分离制备DNA，其碱基一部分被甲基化，影响酶识别和切割能力，甚至不能切割。星号活性：限制性酶对底物的特异性降低，导致切割非特异识别位点，电泳弥散（smear）。尽可能降低甘油浓度，在中性pH和高盐离子浓度下进行酶切反应。缓冲液与温度：每种酶都有最适反应缓冲液，应在最佳工作温度下和反应缓冲液中进行。酶量与反应时间：增加酶量，相应缩短时间。质粒纯度不很高，酶切反应通常在数倍过量