脑组织总RNA提取.doc

脑组织总RNA提取（2004-3-22）na) (GIBICOBRL LIFE TECHNOLOGIES,TRIZOL Reagent ,CAT.no.15596-026,Store at 2 to 8 ℃,Size:100ml ) mRNA’s+hnRNA’s(分散的高分子量RNA) 7kb~15kb ribosomal RNA:28S( ~5kb) 4.6~5.3kb ribosomal RNA:18S (~2kb) 1.8~2.0 kb tRNA,5S 0.1~0.3kb 匀浆—相分离—RNA沉淀—洗RNA—重溶RNA -70℃取出脑组织，待其融化，用镊子取部分组织放入EP管（已称重去皮）中，称重 292mg(300mg:3mlTrizol，每50-100 mg组织加1 ml TRIZOL Reagen) 将组织转入匀浆器中，加入1mlTRIzol Reagen 匀浆(旋转进入，旋转退出) 加入2mlTRIzol Reagent（共3ml），混匀 （如组织100mg，可用少量先匀浆，剩余TRIzol Reagen冲洗匀浆器） 约每一毫升匀浆液移入一个EP管，15-30℃下孵育5分钟（以使核蛋白复合物完全分解） 每管加0.2ml的氯仿,盖紧用力颠倒震晃15秒，15-30℃下孵育2-3分钟，离心 {无色上层水相（为TRIzol Reagent体积的约60%,RNA）,中间相（DNA），底部红色酚-氯仿相/有机相（蛋白）}（注：应正确加量否则会不分相。） 4℃ 12000g 15分钟（注：从离心机取出时勿倾斜勿震摇） 水相移入EP管（不要搅动交界面，中间相和酚-氯仿相可用来提DNA和蛋白质） 加入0.5ml异丙醇混匀，15-30℃孵育10分钟，离心 4℃ 12000g 10分钟（RNA沉淀） 枪头去上清，加入70% （？？？75%）乙醇（DEPC水配）1ml，涡旋混匀，离心 4℃ 7500g 5分钟 枪头去上清（注：乙醇洗涤后白色RNA沉淀物会变松,去上清时要小心不要丢掉沉淀物） 空气/真空干燥5分钟（时间太长会大大降低RNA溶解性） 0.1%DEPC处理的RNAase-free的水溶解20μl/管,轻摇混匀,室温静置20分钟 （????反复吹打RNAase-free水，使RNA溶解，55℃-60℃孵育10min） --70℃保存 注1：所有器械，EP管，枪头均用用0.1%的DEPC水浸泡24小时,烘干,高压蒸汽消毒 玻璃仪器150°C烘烤4 h,塑料仪器在0.5M NaOH中浸泡10min,彻底清洗，高压灭菌消毒 超净台内两层手套操作，每次离开均将外层留在超净台内，或回来后更换手套 注2：匀浆后加入氯仿前，样品置于-60到-70℃可保存一个月；RNA沉淀物（乙醇）在75%乙醇，-5到-20℃条件下可保存一年 鉴定：琼脂糖电泳有明显28S、18S两条带，5S的条带可见但不明显。但在28S、18S两条带前后尤其18S前后均有明显离散RNA，显示降解。主要原因应为组织为冰冻组织，而非新鲜组织。 A260/280 1.6，=部分降解。 mRNA提取(Promega,PolyATtract mRNA Isolation Systems)（2004-03-23/04-01） (SystemsⅢ and Ⅳ，每次总RNA1mg) 玻璃仪器200°C烘烤过夜；塑料仪器在0.1N NaOH，1mM EDTA中彻底清洗,随后用无RNA酶水清洗；COREX管用DEPC处理，不烘烤。 1．探针退火 1.5mlEP管中加入总RNA（0.1mg~1.0mg） 加入RNase-free水使体积至500μl 65°C热休克 10 min 加入Biotinylated-Oligo(dT) Probe3μl和20×SSC13μl，轻柔混合，室温孵育(=10min)直至完全cool 2．0.5 ×SSC,0.1×SSC准备 1.2ml 0.5×SSC: 20×SSC(30μl)+RNase-free水(1.170ml) 1.4ml 0.1×SSC: 20×SSC( 7μl)+RNase-free水(1.393ml) 3.清洗Streptavidin-Paramagnetic Particles（SA-PMPs）（flick）SA-PMPsSA-PMPs完全分散 SA-PMPs管放在磁力架（Magnetic Stand）上，至SA-PMPs聚集在管一侧（约30秒）