总RNA的提取定量与RT-PCR.doc

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 级临床八年制 组 别： 第二实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 (Title of Experimetn) 总RNA的提取、定量与RT-PCR 实验日期 (Date of Experiment) 11月27日 实验地点(Lab No.) 第二实验室 合作者(Partner) 指导老师(Instructor) 总分 (Total Score) 教师签名(Signature) 批改日期 (Date) 【预习报告】 实验原理 1)总RNA的提取与定量 在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于western blotting。 2)逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。 该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 实验材料 1)总RNA 的提取 1. 紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管 2. Trizol试剂 3. 氯仿 4. 异丙醇 5. 75℅乙醇 6. 无RNase的水或0.5℅SDS (溶液均需用DEPC处理过的水配制) 2)RT-PCR 1. 基因扩增仪(如PE GeneAmp PCR System 2400 或 9700)、微量加样枪、凝胶成像系统、灭菌超薄PCR反应管 2．RNA提取试剂 3．第一链cDNA合成试剂盒 4．dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L 5．Taq DNA聚合酶 实验步骤 （一）总RNA的提取 1. 匀浆处理: a.组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml Trizol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过Trizol体积10℅。 b.单层培养细胞 直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 c.细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或