动物细胞培养..docx

动物细胞培养第一章1.1动物细胞培养基本概念动物细胞培养技术：从机体中取出组织或细胞或利用已建立的细胞系（株），在待定的人工条件下使细胞在培养容器中生长或生产生物制品的一门技术。细胞培养泛指所有的体外培养。体外培养（culture in vitro）是指将活体结构成分（如活体细胞、活体组织、活体器官等）甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，置于类似于体内生存环境的体外环境中生长和发育的方法。就培养物而言，体外培养分为细胞培养、组织培养和器官培养。细胞培养（cell culture）是指在体外条件下，用培养液维持细胞生长与增殖的技术。组织培养（tissue culture）是指从机体分离出的组织或细胞在体外人工条件下培养生长的技术。器官培养（organ culture）指的是将部分或整体器官在不损伤正常组织结构的条件下进行的培养，即仍保持组织的三维结构，并模仿在各种状态下的器官功能。体外培养优点：理化环境可精确调控，生理条件相对恒定；对于同一来源的组织样品，随着传代进行，细胞系逐渐趋于均一；培养过程经济有效且可规模化；可模拟细胞体内环境。体外培养局限性：对操作者的专业技术技能要求高；能获得的细胞量较少（实验室：1-10g细胞/批，企业：100g细胞/批）；培养过程中易出现细胞去分化和选择性培养的现象；在传代培养中需对细胞进行鉴定并调节培养条件；培养细胞的不稳定性（染色体组成不稳定、去分化、转化等）。体内外培养细胞的差异和原因：体内外培养的差异：功能差异：在体外培养条件下，细胞降低甚至丧失了其在体内的合成、分泌等功能，即细胞分化特性减弱或不显。生长和增殖差异：细胞在生长方式、移行方向、增殖能力等方面改变。体内细胞所处微环境：由细胞本身、支持细胞胞外基质、可溶性分子、用力、毛细血管以及神经等要素构成，调控着细胞在体内的命运。体内外培养细胞的差异的原因：失去体内神经系统和内分泌系统对功能细胞的调节作用；丧失支持细胞与功能细胞的相互作用；缺少支持物（细胞外基质）对功能细胞的作用；改变功能细胞生长繁殖的三维几何空间环境；缺乏功能细胞生长繁殖所需的应力等物理因素。——需要理解和认识细胞特性和所处的微环境，通过优化细胞外培养环境，使细胞更好地生长、实现功能，生产生物制品。1.2现代动物细胞培养技术的建立结论：离体的动物组织在培养条件下具有近乎无限的生长和繁殖的能力，组织培养是研究组织和细胞的极好方法。培养技术：胰酶消化——建立细胞系——单层细胞单细胞分离培养——克隆细胞株灌流小室——更新培养基——间歇换液培养——灌注培养培养装置：卡氏瓶——试管——培养瓶——滚瓶——反应器培养基：天然培养基——人工合成培养基含血清培养基——无血清培养基——低蛋白、无蛋白培养基1.3动物细胞培养的产品细胞培养可以：生产细胞因子、酶、抗体等蛋白制品；生产病毒疫苗、病毒载体等；生产干细胞、成体细胞或组织等制品；体外分析、药物筛选等模型和基础研究。动物细胞表达药物成为生物医药发展主流投放市场以及临床中试的重组蛋白有70%由哺乳动物细胞培养表达。治疗性抗体药物均采用动物细胞大规模培养方式生产。国内疫苗生产现状：生产方式：滚瓶机细胞株：鸡胚或原代细胞培养基：需添加10%血清缺点：批量小、批间差异大、质量不稳定、劳动强度大、占用场地多、效率低等工程化组织体外构建中存在的问题：构建过程中需要手工操作；培养条件无法控制；过程参数无法检测；对组织构建过程中环境要求知之甚少；过程放大受到限制——严重制约组织工程产品研制及未来规模化工业化生产第二章2.1细胞成分和化学环境人体的细胞组成：据统计，成人有机体大约有1014个细胞，刚出生的婴儿大约有1012个细胞；1g哺乳动物的肝或肾组织大约有2.5~3亿个细胞；人体中大约有200多种不同类型的细胞，根据其分化程度可分为600多种，它们的形态结构与功能差别都很大，但是都是由一份受精卵通过分裂与分化而来；大多数细胞在培养时大约直径在12-18μm；某些类型的干细胞相当小，且只有少量的细胞质；与此相反，在肝脏内的某些细胞（如肝细胞）是相当大，平均直径为20μm的细胞。案例一：MSCs群体大致可分为两种：RS细胞：形态细态（7μm），增殖迅速，扩增能力较弱，克隆形成能力高；成熟干细胞：形态宽大，扩增能力较弱，不具克隆形成能力。案例二：从骨髓里分选出very small embryonic-like stem cells（VSELs）直径：VSELs:3.630.09 μm，HSCs:6.540.17 μm；核/质比：VSELs：1.5，HSCs：0.8细胞质面积：VSELs：6μm2，HSCs：35μm2水：占尽80%；蛋白占10~20%。碳水化合物是细胞物质和能量基础，形成能量代谢的中间体，作为核苷酸一部分，组成糖蛋白，糖脂等，游离的碳水化合物