translation-A Strategy for Modulation of Enzymes in the Ubiquitin System.doc

对于蛋白质的翻译后修饰的对手泛素系统的生物学重要性，并且可能超过该磷酸化的。因此，人们在破译蛋白质泛素化和去泛素化在正常和疾病状态的作用极大的兴趣。泛素是共价键通过一个级联的酶的活性，E1→E2→E3，其可通过泛素结合结构域（UBDs）的队列中读取，并通过去泛素化酶逆转缀合蛋白质小，高度保守的蛋白。泛素单体和不同的键的链可被组装在基板上，而这种复杂的代码可以通过26S蛋白酶体靶向底物的降解或改变其相互作用，定位，或活性。 58个人的泛素特异性蛋白酶（USPS），其代表一个以上的已知配音一半，已经引起注意，因为潜在的治疗靶标。众多卖点有牵连的癌症和其他疾病，包括神经变性，血液和感染性疾病。卖点是具有良好定义的催化裂口（14）共用一个结构保守催化结构域的半胱氨酸蛋白酶。因此，有可能开发一种通用结构为基础的策略，用于抑制家庭成员使用类似但具体的分子实体，如已针对已经靶向与建立在共同的支架的小分子激酶的情况。然而，美国邮政或其它配音的只有少数弱抑制剂已被报道。对于配音的特异性抑制剂的缺乏妨碍了当局试图理解和操作去泛素化途径的治疗效果。 我们制定了一项战略，以利用泛素作为支架来生成卖点的高度特异性和有效的抑制剂，然后扩展的方法来攻击其他DUB家庭，酶E2 ，E3酶， UBDs 。 USP基材包含通过其C-末端羧基基团共轭的在靶泛素蛋白或基片的赖氨酸基泛素部分。尽管低的序列相似性，USP催化结构域共享一个共同的折叠，其中包括一个结构保守泛素 - 结合位点的近侧泛素。 为了帮助我们的抑制剂的设计策略，我们解决了USP21在复杂的结构，用自杀底物泛素部分形成其C末端与酶的催化半胱氨酸（表S1）之间的共价键。泛素的叠加： USP21复杂的结构与其他四个泛素结构： USP复合物表明，泛素占据一个类似的网站上的所有五个酶（图1A） 。 UB和卖点之间的接触面大;例如， 1835和1645 A2被掩埋UB和USP21的表面上，分别。约75 ％ USP21上的泛素结合表面的组成并非美国药典家庭（图1B和图S1）内的保守残基。 图。 1 结构原理和设计库为泛素为基础的USP抑制剂。泛素在复杂USP21 （A ）叠加（蓝色; PDB条目3I3T ） ， USP2a （绿色; PDB条目2HD5 ） ， USP5 （黄色; PDB条目3IHP ） ， USP7 （洋红色; PDB条目1NBF ） ，和USP14 （红色; PDB进入2AYO ） 。与完整的坐标为泛素进行叠加：USP配合物，但为清楚起见，只USP21显示（灰色）。 （二） USP21的泛素结合位点。 USP21被示为一个分子的表面，并且形成泛素结合位点的残基是红色或蓝色，这表明残基是50 ％或≥50％保守的，分别在第48人类卖点（图S1）的序列。 （三）噬菌体展示泛素库的设计映射到泛素结构（ PDB条目1UBQ ） 。的泛素主链被示为灰色管，并且分别在图书馆多样化位置上被示为球形，着色如下：区域1 ，紫色;区域2 ，蓝色;而区域3 ，橙色。 （D）对象库中的设计区的一级序列。多元化的序列阴影和彩色如（ C） 。两个文库。当中的阴影序列，图书室1个（ 7 ×1010不同的变体）并没有针对六区3的位置（ 73 ?78 ） ，和库2 （ 9 × 109不同的变种）未达标四个位置的区域2 （35， 37，39，和40）。 由于泛素结合卖点与低亲和力而是通过一个大的接触面积，我们的理由是，我们应该能够使泛素基因突变，优化分子间的接触，增强对特定的USP亲和力。因为卖点的泛素结合位点各不相同的序列，即紧密结合为一个USP泛素变异体不应与其他卖点进行交互。紧密结合泛素变异体应通过阻断承认自然的泛素化底物作用的催化活性的竞争性抑制剂。为了验证我们的假设，我们构建组合，噬菌体展示的泛素变异体对不同的卖点和其他泛素相关蛋白选择库。 我们所定义的USP-结合位点为30 ?泛素残留，使在泛素与USP21联系人： USP21复杂的结构（图1 ， C和D） 。我们构建使用青睐野生型（ WT）序列，但在整个泛素结合位点（ 23 ， 24）允许多样性的软随机化策略2噬菌体展示库。这种方法使之与改进对于特定的USP亲和力没有显着改变的结合相互作用的突变的变体的选择。 结合的选择产生了变体结合至USP8 ， USP21 ，或USP2a （图2A和表S2 ），但其它不到10卖点（图2B） 。我们还分离出变异，选择性地绑定到其他两个DUB家庭成员：卵巢肿瘤蛋白酶（ OTU ）家庭成员OTUB1 和Brcc36含异肽复合物（ BRISC家庭成员的JAB1/MPN/MOV34金属酶（ JAMM ） 。我们还确定了变异，选择性地绑定到同源的E6 -AP羧基末端的E3 （ HECT ）域酶神经前体细胞表达发育下调，蛋白4 （ NEDD4