实验二 萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定.docx

实验二 萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定研究背景及目的即便是同一种酶，在体外测定酶活性时在不同的测定方法和不同的材料、时期中，实验测定的具体细节设计却大不相同，体外酶活性的测定实验在生化实验中更是经典的实验案例。本次实验是淀粉酶活性的测定，通过实验进一步体会实验的细节设计。利用酶促反应测定萌发的小麦种子种淀粉酶的活力以及水溶性蛋白质的含量。原理1.淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总成，可以分成α-淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种。实验中测定萌发的小麦种子的酶活力，因为材料中两种酶都含有，所以要采取一定方法分别测定两种酶活性。利用两种酶不同的特性，α-淀粉酶不耐酸，pH3.6以下钝化，而β-淀粉酶则不耐高温，高温下易钝化，将β-淀粉酶钝化测得α-淀粉酶活性，再测总酶活性，相减即得到β-淀粉酶活性。（C6H10O5）n + 0.5nH2O淀粉酶，40℃ 0.5nC12H22O11C12H22O11 + 3,5-二硝基水杨酸 3-氨基-5-硝基水杨酸淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制 作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位 重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。2.利用Folin-酚法测定萌发小麦种子中水溶性蛋白的含量。在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。[1]仪器与试剂仪器：离心机（飞鸽牌系列离心机，TDL-40B），722-型分光光度仪（上海分析仪器总厂），DK-SR四型电热恒温水浴锅（上海精密实验设备有限公司），双列八孔电热恒温水浴锅（天津市中环实验电炉有限公司），冰浴微量可调手动移液器（大龙牌），研钵，容量瓶天平（上海精密科学仪器邮箱公司，双杰牌JP-100架盘药物天平）2．试剂萌发的小麦种子，3，5—二硝基水杨酸溶液，1%淀粉溶液，柠檬酸缓冲液0.4MNaOH溶液，麦芽糖标准液,A液，B液，试剂甲，试剂乙操作步骤制备酶液：2g萌发小麦种子研磨，用蒸馏水浸提，稀释成50ml，一部分3500转/分离心20min，取上清液备用，另一部分过滤，取滤液备用。Folin-酚法测水溶性蛋白。取过滤的滤液，按下表配制稀释。各加5ml试剂甲混匀，10min后加试剂乙0.5ml，立即混匀，放置30min，测定各管溶液消光值。管号123456789滤液体积（ml）蒸馏水（ml）OD650测定酶活性。α-淀粉酶：取上清液1ml,加入四支试管中，其中两只为对照试管，两只为测定试管。在70℃恒温水浴中放置15min，立即冰浴冷却4~5min，加入1mLpH5.6柠檬酸缓冲液，再40℃恒温水浴15min。对照管加4mL0.4M NaOH，40℃预热的淀粉溶液2mL，摇匀，40℃恒温水浴5min→测定管加4mL 0.4M NaOH，摇匀。总酶活性：取5mL酶液，在100ml容量瓶中稀释至刻度，混合均匀，取两支对照管，两支待测管，各加入1mL稀释后的酶液和pH5.6柠檬酸缓冲液1mL，40℃恒温水浴15min，之后在对照管中加4mL0.4M NaOH，在四支试管中加入40℃预热的淀粉溶液2mL，摇匀，继续40℃恒温水浴5min，测定管加4mL 0.4M NaOH，摇匀。麦芽糖标准曲线：取7支15mL具塞试管，分别编号，按表中加液体。从B）C）8支试管中分别取出1ml溶液，分别放入15ml具塞试管中，加入1ml 3,5-二硝基水杨酸试剂，混匀。将以上8只具塞试管同C）中试管共15支共同沸水浴5min，冷却后将C）试管中溶液稀释至15mL，混匀，15支试管内溶液均在520nm下进行比色。数据整理1.标准曲线试管号1234567麦芽糖溶液浓度（mg/ml）0OD52000.0490.1940.3270.5000.6400.7092．样品试管号α对照1α对照2α测试1α测试2总对照1总对照2总测试1总测试2OD5200.3060.3000.5550.5450.0120.0220.4850.496麦芽糖浓度（mg/ml）0.4360.4270.7910.7760.01710.03130.6910.707牛血清蛋白标准曲线试管号123456蛋白质含量 （μg/ml）050100150200250OD65000.1080.1910.3190.4000.514水溶性蛋白样品数据待测液体积（ml）1号管OD6502号管OD6503号管OD650蛋白质含量（μg/ml）蛋白质含量（%）0.10.2350.2250.242117.02.93%0.20.4360.4560.445223．02.79%0.