植物组织中的总DNA的提取.doc

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植物组织中的总DNA的提取

渤海大学学生实验报告 课程名称: 任课教师: 实验室名称: 房间号 实验时间: 年 月 日 学院 化学化工与食品安全学院 专业 班级 姓名 学号 同组人 实验项目 组别 实验成绩 实验二 植物组织中总DNA的提取 实验原理 核酸是生物体中的重要成分,核酸以两种方式存在,即DNA和RNA。DNA存在于细胞的特定部位,主要存在于核内即染色体DNA(基因组DNA),少量存在于细胞质内及细胞器内(mDNA,cpDNA),细胞内各种DNA总称DNA。在生物体内它常与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。在制备总DNA时,用温和的方法使细胞破碎后,核蛋白释放出来。同时加入去污剂使蛋白体解析,然后使DNA沉淀与液相中的蛋白质,多糖等杂志分离。 总DNA提取方法很多,从提取原理上看主要有两种:CTAB法和SDS法。 CTAB法:在提取缓冲液中含有一定浓度的CTAB,CTAB能与核酸结合形成复合物,利用氯仿抽取,去除核蛋白,再用异丙醇或无水乙醇沉淀核酸,所得DNA约50kb左右。 一·实验目的 掌握从高等植物组织中提取总DNA的原理,方法。 了解并掌握微量移液器,离心机的使用方法。 二·实验材料 鲜嫩的植物叶片或将植物叶片放入研钵中冷冻-70c超低温冰箱备用 三·实验器材及试剂 实验器材 台式冷冻离心机,水浴锅,微量移液器,研钵,离心管,制冷剂,高压灭菌锅,冰箱,恒温干燥箱,烧杯。离心管架等。 主要试剂 CTAB提取缓冲液 CTAB 2%(w/v) (溶解细胞膜,与核酸形成复合物) NaCl 1.4mol/L (高盐,CTAB—核酸复合物可溶) EDTA 20mmol/L (抑制核酸酶) Tris 100mmol/L (提供生理环境) 氯仿/异戊醇(24:1) RNaseA 10mg/ml -20C保存 无水乙醇或异丙醇 ?-硫基乙醇 76%乙醇+0.2mol/L NaAc 7.1xTE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl(ph8.0) 1 mmol/L EDTA(ph8.0) NaAc 3 mol/L 四·实验步骤 取材,破膜,抽提去蛋白质等杂志,沉淀核酸。 取约2g鲜嫩的植物叶片放入研钵,迅速在研钵中加入-196C液氮,将植物组织迅速研磨成粉末后,转入预热的装有3mLCTAB提取缓冲液的离心管中,使之充分混合均匀,与65C水浴保温30min,不时均匀。 以10000rpm离心10min,移上清至另一离心管中。 冷却至室温后,加入等体积(3mL)的氯仿/异丙醇(24:1)进行提取,轻轻地颠倒混匀10mim。 室温下10000rpm离心10min,移上清至另一离心管中弃沉淀。 在上清液中加入2/3体积预冷(-20C)的异丙醇,轻缓颠倒混合均匀,冰浴放置10—20min。沉淀DNA。 室温下10000r/min离心10min,弃上清液。 用1mL预冷的75%乙醇洗涤2次,以除去残留的盐。 37C干燥后(10min),讲沉淀物溶于100uL灭菌去离子水中,转移至1.5mLEppendof管中。 加入RNaseA至终浓度为10ug/ml,37C保温1h。 加入300uL灭菌的去离子水稀释上述样品,增加体积以减少下一步抽取过程中DNA的损失,用等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽取2-3次,室温7000rpm离心10min取上清。5% 上清液中加入1/10体积3mol/LNaAC溶液混匀后,再加入2倍体积的无水乙醇,放置20min后,室温下10000rpm离心10min,沉淀DNA。 用预冷的75%无水乙醇洗2次,37C保温干燥后,溶于0.1xTE中,4C冰箱保存备用。 五·实验现象 六·思考题 植物总DNA提取中应注意什么问题? 2.植物总DNA提取的原理是什么? 渤海大学实验报告用纸(第 页 共 页)

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