f.hao.cDNA文库构建.doc

cDNA文库构建 ??? 构建cDNA文库是研究功能基因组学的基本手段之一。cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。通过构建cDNA表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此，cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。?? 一．构建原理 ??? cDNA文库不同于基因组克隆克隆克隆克隆 A(μl) B(μl) C(μl) D(μl) λ噬菌体DNA(0.5μg/μl) 1.0 1.0 1.0 1.0 10×T4DNA连接酶缓冲液 1.0 1.0 1.0 1.0 cDNA 0 ng 5 ng 10 ng 50 ng T4噬菌体DNA连接酶（105 Weiss单位/ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 10 mmol/L ATP 1.0 1.0 1.0 1.0 加H2O至 10 10 10 10 连接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA储存于-20℃。 2．按包装提取物厂商提供的方法，从每组连接反应物中取5μl包装到噬菌体颗粒中。 3．包装反应完成后，在各反应混合物中加入0.5ml SM培养基。 4．预备适当的大肠杆菌株新鲜过夜培养物，包装混合物做100倍稀释，各取10μl和100μl涂板，于37℃或42℃培养8~12小时。 5．计算重组噬菌斑和非重组噬菌斑，连接反应A不应产生重组噬菌斑，而连接反应B、C和D应产生数目递增的重组噬菌斑。 6．根据重组噬菌斑的数目，计算cDNA的克隆效率。 7．挑取12个重组λ噬菌体空斑，小规模培养裂解物并制备DNA，以供适当的限制性内切核酸酶消化。 8．通过1%琼脂凝胶电泳分析cDNA插入物的大小，用长度范围500bp~5kb的DNA片段作为分子质量参照。