环境水样品中大肠杆菌及粪(耐热)大肠杆菌的检测.doc

环境水样品中大肠杆菌及粪（耐热）大肠杆菌的检测 【摘要】本次实验采用多管发酵法检测环境水样中大肠杆菌及粪大肠杆菌（环境水样取用水果湖样点水样）。本次试验（多管发酵法）的主要步骤为：将待测水样稀释三个（实际上做了四个）适宜稀释倍数梯度，接种在乳糖蛋白胨培养液中，37℃下培养24h，观测结果。产酸产气为阳性结果，不产酸产气为阴性。将阳性管中菌液取定量接种于EC肉汤培养液中，45℃下培养24h，观测结果。产酸并产气为阳性结果，不产酸不产气为阴性。将阳性管中菌及之前37℃管中菌接种于伊红美蓝培养基上，于对应温度下培养24h，镜检。根据菌落形态和颜色，可确认大肠杆菌阳性结果。根据大肠杆菌阳性管数的MPN检索可查水样中总大肠杆菌和耐热大肠杆菌的最大或然数。再与《中华人民共和国地表水环境质量标准》(GB3838-2002)对比，判定水质。 【关键词】 环境水样 大肠杆菌 耐热大肠杆菌 多管发酵法 最大或然数（MPN） 产酸产气 【前言】水体的污染程度可大致由总大肠杆菌数及耐热大肠杆菌数反映出来。大肠杆菌为革兰氏阴性菌，无芽胞，糖代谢时可产酸产气，可使溴甲酚紫由紫色变为黄色，并可通过伊红美蓝培养基鉴定，大肠杆菌发酵乳糖造成的酸性环境，使两种染料结合成复合物，使菌群产生带核心的，有金属光泽的深紫色菌落。耐热大肠杆菌是一种特殊的大肠杆菌，由于它多见于人类或动物的粪便中，可耐高温，当由37℃环境变为45℃时，依旧可以正常生长。当水体被粪便污染时，其含量较高，由此判断水质高低。 【材料与方法】： 材料 乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml、蒸馏水1000ml （10ml/试管+小倒管 20支） EC肉汤培养基：胰蛋白胨20g、3号胆盐1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾4g 、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml （10ml/试管+小倒管 10支） 伊红美蓝培养基：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、琼脂20~30g、2%伊红水溶液20ml、0.5%美蓝水溶液13ml、蒸馏水1000ml （150ml/瓶） 4.5 mL无菌水：4支 （二） 器材 无菌1 mL移液管：4支； 40~200 微升移液器、吸气器：各1支； 200微升无菌Tip：20只； 载玻片和盖玻片若干； 革兰氏染色各试剂； 培养皿若干套； 酒精灯； 显微镜等 原理及方法 样品的稀释和培养： 取原环境水样0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成 10-1样品；再从10-1样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-2样品；再从10-2样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-3样品，再从10-3样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-4样品，每个稀释度两管。再从10-1、10-2 、10-3和10-4样品中各取1ml到乳糖蛋白胨培养基中（每个稀释度样品各5支试管） 2、初发酵实验： 发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH 方法：（1）将上述15支试管放入37℃中培养24h； （2）取出试管观察，若发现试管由紫色变成了黄色，即证明产酸；若发现小倒管中有气泡产生，即证明产气； （3）记录各试管的产酸产气的情况，将阳性反应（产酸产气）的试管中的样品取一滴（50μ）L转接于EC培养基上，并做好标记。 注：在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应视为可疑结果。48h培养后仍不产酸产气的为阴性反应。 原理：37℃下培养产生阳性反应的试管样品不一定是全部都是粪大肠杆菌，经过45℃下培养，若还能产生阳性反应的即可能为粪大肠杆菌（耐热性较好） 方法：（1）将上一步接种的EC培养基的试管置于45℃下培养24h； （2）取出试管观察，记录发生阳性反应的试管（产酸并产气） 4、平板分离： 原理：伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）阳性菌落。 方法：（1）将37℃培养管（48h）和45℃培养中的发生阳性反应的试管中的菌接种于伊红美蓝培养平板，分别再 （2）培养过夜后取出平板，挑选深紫色、具金属光泽，紫黑色、不带或略带金属光泽，淡紫红色中心颜色较深的菌落。 5、革兰氏染色：