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提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率 摘要：对于基因工程，无论是在原核生物中，还是在真核生物中，外源基因的表达效率一直是人们关注的问题。这篇综述简要的从启动子、质粒、mRNA转录本、密码子的偏好性、宿主选择、培养条件方面论述如何提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率。 关键词：真核基因 大肠杆菌 表达效率 前言：基因工程越来越被广泛应用，人们可以利用基因工程获得高产,稳产和具有优良品质的农作物,培育出各种具有抗逆性的作物新品种利用基因技术还可以高效率的生产各种高质量低成本的药品如胰岛素干扰素和乙肝疫苗等 二、影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素有： 启动子 质粒 mRNA转录本 密码子的偏好性 宿主选择 培养条件 （一）启动子 在基因的表达调控中，转录的起始是个关键某个基因是否能正常的表达常常决定于特定启动子的起始过程，启动子是DNA分子与RNA聚合酶相结合的部位，是转录的基本信号。 最佳启动子应具备的条件是：能够克隆的基因蛋白质产物表达量占细胞总蛋白的10%~30%以上，应能呈现出底限的基础转录水平，即本底转录低，因为在表达毒性蛋白质或有损于寄主细胞生长蛋白质情况下，使用高度抑制型的启动子是极为重要的，若是基因表达的产物对宿主细胞无害，则可用强启动子。这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理（如热）和化学（如IPTG）诱导 。 大肠杆菌启动子的序列结构具有两个保守序列，即-35区（5’-TTGACA）和-10区（5’-TATAAT），后者又叫Pribnow盒。应用半乳糖激酶系统检测结果表明：启动子序列与上述保守序列之间相似程度越高，其表达能力也就越强，两者呈正比关系。 两个保守序列之间的距离也影响克隆基因的表达效率，这段间隔距离越接近于17个碱基，启动子的活性就越强。 研究发现，启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率也有影响： 图中示出 pTR161质粒的从lac启动子到cro基因转译起点间的碱基序列。还示出pTR161质粒的8种派生质粒的序列缺失程度。数字表示相对于pTR161的蛋白质合成数量。 结果表明：携带不同重组体质粒的菌株所合成的cro蛋白质数量，是同lac-cro基因的结合区序列相关联，但这种相关性并没有一定的规律；但 5’端与SD序列之间的距离应(15bp。 （二）质粒 质粒对目的基因表达效率影响体现在： 1 质粒拷贝数 拷贝数的增加不一定使表达水平增强，反而更容易引起重复序列间的异位配对导致基因沉默（van.Blokland et al.,1994）Joy和Steven对果蝇brown基因进行转化研究发现，当该基因存在重复序列时，会引起基因间的同源配对，并导致此区域的异染色质化，对基因的转录产生抑制。Li et al(2006)在烟草中也发现随拷贝数增多表达效率下降的现象。此外，用质粒做载体时，由于序列一同被转录，也增加了产生同源抑制的几率。 由于细胞中的核糖体数量与任何一种mRNA分子数量相比，都是大大超量的。因此，增加mRNA分子数量是提高克隆基因表达效率的有效途径。 增加mRNA分子数量的因素有两种：（1）启动子强度；（2）基因的拷贝数，即基因剂量；最简易的方法是将基因克隆到高拷贝的质粒载体上。 2质粒载体的稳定性 天然质粒都可以稳定地保持在寄主细胞内，这是由于它们具有一段分配功能区Par所致。分配功能区Par能够保证质粒分子在每次细胞周期中都能准确地分离，并均匀地分配到子细胞中去。 克服质粒丢失的方法 （1）将Par克隆到表达载体； （2）对无质粒细胞进行反选择。大体步骤为：使携带目的基因的质粒同时带上编码(启动子的(cl基因，形成特殊的重组质粒。然后用一种启动子缺陷的(突变体感染携带这种重组体质粒的大肠杆菌寄主细胞，使之成为溶源性细菌。在这种溶源性细菌中，重组质粒的丧失，伴随着发生(阻遏物的丧失，则原噬菌体便被诱发进入溶菌生长周期，从而使寄主细胞裂解死亡。 （三）mRNA转录本 许多细菌基因起始密码子5’上游都存在5—10个核苷酸的核糖体结合位点（RBS），特称为SD序列。它包含5’-UAAGGAGG-3’的全部或其中一部分。 已经鉴定出SD序列与16S rRNA分子之间的碱基互补程度，可明显地影响mRNA的翻译速率。当此序列为5’-GGAGG-3’时，可与16S rRNA 3’端区段完全互补，翻译效率最高；而当该序列发生单碱基突变时，翻译效率便下降30倍之多。 连接在SD序列后面的4个碱基成分的改变，会对翻译效率发生很大影响。如果这个区域是由4个A或4个T碱基组成，其翻译最有效；而当是由4个C或4个G碱基组成，翻译效率则只及最高翻译效率的50%或25%。 直接位于起始密码AUG上游的三个碱基的三联体组成，同样也对翻译效率发生影响。以(-半乳糖苷酶