血清Alb、γ-G测定-.doc

实验名称 实验日期 2014-10-16实验地点 第5实验室 合作者 指导老师 评分 教师签名 批改日期 20 实验目的1.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5.了解柱层析技术 二、实验原理α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16%，100ml血清中约含1.2g左右。 首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。 用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。α－球蛋白、β-球蛋白的PI6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH=6.5的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下： 如需知道用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一,可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。 三、材料与方法 （8）氨基黑10B染色液 （9）漂洗液 3.器材 离心机、刻度离心管、铁架台、移液管、葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱 、 二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、比色板、常压电泳仪、电泳槽、醋酸纤维素薄膜（2×8cm）、载玻片或盖玻片、点样器、玻璃板、培养皿、滤纸、镊子 4.实验步骤 （1）粗提——盐析法进行粗分离 取离心管一个，加入0.8ml小牛血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀后室温下放置10min，离心10min（4000r/min）。用滴管小心吸出上清液置于试管中，作为纯化清蛋白之用。向离心管的沉淀加入0.6mol蒸馏水，振摇使之溶解，作为纯化γ球蛋白用。 （2）脱盐——葡聚糖凝胶G-25层析 葡萄糖凝胶G-25层析柱经0.02mol/L、pH=6.5?NH4AC缓冲液流洗平衡后，取下恒压储液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夹，使层析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床液面。用细长滴管吸取上述经盐析所得的粗制蛋白质溶液，小心而缓慢的加入凝胶床上面，柱下端用10ml刻度离心管接液，拧松柱下螺旋夹，调节适当流速，使样品进入凝胶床，至液面降到凝胶床表面为止。小心用0.02mol/L、pH=6.5?NH4AC缓冲液洗涤层析柱内壁，以洗涤粘在柱壁上的蛋白质样品液。待样品液进入凝胶床内，继续用0.02mol/L、pH6.5?NH4AC缓冲液流洗，同时注意流出液量。在黑色反应板凹孔内加2滴0.92mol/L磺基水杨酸，随时检查流出液是否含有蛋白质，滴流出液1滴黑色反应板凹孔内接触到磺基水杨酸溶液，若出先白色混浊或沉淀，表示已有蛋白质流出（当凝胶床体积为5.5ml时，流出的液体量约为2ml就可能有蛋白质流出），立即收集流出的蛋白质溶液。收集约12滴后，滴流出液1滴于预先加有1滴0.05mol/L(1%)BaCl2的黑色反应板凹孔内，一旦见出现白色沉淀（表示有SO42-），立即停止收集?收集的蛋白质溶液即可分别过DEAE纤维素柱，进行离子交换层析。收集蛋白质溶液后的凝胶层析柱继续用0.02mol/L?pH=6.5?NH4AC缓冲液流洗，用BaCl2液检测层析柱流出液，当流出液用BaCl2检查SO42-为阴性后，继续洗涤2~3ml。凝胶层析柱即可再生平衡，可再次使用。 （3）纯化——DEAE纤维素离子交换层析 A）DEAE纤维素阴离子交换层析柱 经处理再生好的DEAE纤维素层析柱，取下其恒压储液瓶管塞。小心控制柱下端螺旋夹，使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面。柱下端用10ml刻度离心管收集液体，以便了解加样后液体的流出量。将除除盐后收集的球蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上，调节层析柱下端的螺旋夹使样品进入纤维素柱床，至液面降到纤维素柱床表面为止