单细胞凝胶电泳技术..doc

单细胞凝胶电泳技术的试验步骤 试剂及材料：1） PBS pH7.3：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.3，最后加蒸馏水定容至1L即可。保存存于室温或4℃冰箱中。2）0.8%正常熔点凝胶（PBS配制）3）0.6％低熔点凝胶（PBS配制）4）毛玻璃片 5）盖玻片6）碱性裂解液（2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸钠），临用前加10％DNMSO，1％Triton X-1007）电泳缓冲液（1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH；Tris.Cl，pH7.5）8）EB（2ug/ml）步骤：1.制备第一层胶：100ml 0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4固化10min；2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6％低熔点胶（cell与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4固化10min；3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10％ DMAO，1％Triton X-100），4裂解1h；4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。5.电泳：电压20V，300mA，30min6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min；或双蒸水漂洗2次，每次5～15min，7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。或者4，潮湿，闭光的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。 1.2.5 改良彗星试验操作步骤 为节省实验时间，本研究将铺三层胶法改为铺一层胶法，同时在中和及染色等步骤进行了改良，具体操作如下:将已染毒的淋巴细胞悬液与40的1%低溶点琼脂糖等浓度混匀后，取70μl混合液直接滴加在磨毛玻片上，加盖玻片，4冷凝，20min后揭盖片;4于碱性裂解液中裂解1h;解旋20min;4电泳（25V，300mA）30min;中和5min;加碘化丙啶，暗处染色10min，加盖片;于莹光显微镜下镜检，照像。 1. 各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5 个/ml。 2. 铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。 3. 第1 层凝胶的制备：将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取适量铺于载玻片CometSlide上，再置4℃下10min 使NMA 凝固。也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用（据经验，此法较优）。 4. 第2 层凝胶的制备：低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min 使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。将20μL 细胞（约 104个）和75μL的LMA 混合均匀。然后，迅速将适量含细胞的LMA 滴到第1 层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃10min 使第2 层LMA 凝固。注意，使用盖玻片的目的是使琼脂糖平整显微镜下方便观察，经验丰富者，可以不用，也可以达到好效果。 5. 第3 层凝胶的铺制：:第2 层LMA 凝固后，在室温下小心移去盖玻片，重复第二层的步骤。（此步可以不作，一般铺一层细胞就足够） 6. 细胞裂解： 移去盖玻片，将玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液（配制见试剂使用说明的1，2）。4℃下裂解1-3h。取出载玻片用蒸馏水漂洗2次，要求动作轻柔，以免琼脂糖脱落。 7. DNA 碱解旋： 将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的电泳缓冲液约覆过载玻 片胶面0.25cm 左右，室温放置20min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA 断链在电场中易于迁移。 8. 细胞电泳： 电压15-25V，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节，电泳时间为10-20min。建议预实验，摸索最佳的电压、电流及时间。 9. 电泳后将载玻片置于平皿内。加入蒸馏水，漂洗2次，每次5min，弃去蒸馏水，每载玻片加2-3滴染色剂，盖上盖玻片（也可以不盖上），避光染色10min。盖上盖玻片的目的是可以隔日分析，或便于操作。 10. 观察、拍照和分析： 荧光显微镜515-560nm （绿光）波长的激发光，可清楚地观察到核DNA 和迁移的DNA(即慧星尾)。色泽和图像十分精美，每个样本随机选择20-100 个细胞，图片保存后，用相应的软件分析结果。 。 单细胞凝胶电泳（彗星实验）操作步骤 1. 各种细胞用冰冷的PBS 洗1～2次，离心收集，用PB