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纸层析实验 当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。 滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。 看看接下来会发生什么事情… 纸层析实验 可以看出1号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。 而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。 纸层析实验 这就是纸层析法。 对照上图，可知道1-4号的各代表什么氨基酸。 纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。 第一节 概述 是一种物理分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中。其中一个为固定相，一个为流动相。 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。 色谱的发展史 特点 （1）分离效率高 （2）应用范围广 （3）选择性强 （4）高灵敏度的在线检测 （5）快速分离 （6）过程自动化操作 （7）适用于价格昂贵的产品 按分离机理不同分类 5大类 1、吸附色谱分离 2、分配色谱 3、离子交换色谱 4、凝胶色谱 5、亲和色谱 按固定相形状不同分类 柱色谱 纸上色谱（纸层析） 薄层色谱 其他分类方法 1、根据流动相的物态不同：气相、液相、超临界 2、根据操作压力不同：低压、中压、高压 3、根据洗脱操作时展开方式：迎头法、顶替法、洗脱分析法 分类总结 分类总结 分类总结 色谱分离的规模 4类： 色谱分析：10mg 半制备：10~50mg 制备:0.1~10g 工业生产: 20g/d 色谱分离 根据如下几个方面选择： （1）目的产物的分子结构、物理化学特性及分子量的大小； （2）主要杂质； （3）目的产物在色谱分离过程中生理活性的稳定性。 （二）操作上的不同 分析色谱：进样量愈小愈好，检测灵敏度越高越佳； 制备及工业色谱：进样量越多越好。 （三）色谱分离理论上的不同 1、理论塔板数的不同 2、分配系数不同 3、样品保留值与峰高不同 色谱分离图示 色谱分离图示 一、分配色谱 利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得以分离。 1、分配系数 Kd = C1/C2 K d为分配系数 C1，C2为固定相与流动相中的溶质浓度。 应用条件：温度一定 低浓度 2、阻滞因数 Rf=流动相（浓度中心）的移动速率/流动相在色谱柱中的移动速率 =（r/R） r—溶质（浓度中心）的移动距离 R—在同一时间流动相（前缘）的移动距离 0≤Rf≤1，Rf值越大，溶质随流动相移动的速率就越大，溶质被洗脱的速率也就越快。 3、塔板理论 理论塔板高度是指自这段柱中流出的液体和其中固定相的平均浓度相平衡。 二、吸附色谱 根据吸附剂（固定相）对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的。 离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。 1、等温曲线 指一定温度下溶质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲线。 Langmuir（朗谬尔）吸附等温曲线（凸形线），如图 图说明 凸形吸附等温线是液固系统中常见的一种，它反应溶质分子在固体表面达到饱和时形成单分子层吸附。 凹形吸附等温线表示在低浓度下已吸附分子又能吸附在液相中的分子，从而形成多分子吸附层。 S形等温曲线实际上是凸形与凹形两种等温曲线叠加的产物，它表示被吸附分子之间具有很长的作用力，能进一步吸附其他分子，而溶质分子与固定相表面的作用力相对较弱。 分离因数α 某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数。 0≤α≤1，α=0则溶质不与固定相产生吸附作用，溶质随流动相以相同的速率移动；α=1则溶质都被吸附在固定相上，且不随流动相往下移动。 有效的分离通常要求α至少为0.8 三、凝胶色谱分离 在生物大分子物质制备与生产技术中被广泛应用。 原理示意图（图12-3） 1、层析剂 含义：用于色谱分离技术中的固定相或分离介质。由基质和表面活性官能团组成。 要求及种类 要求： （1）不溶于流动相 （2）化学稳定 （3）机械强度 （4）大的表面积 （5）粒度均匀 层析介质种类 无机（氧化铝，硅胶，活性碳） 有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺） 2、装置 一般由进样、流动相供给、色谱柱、检测及流分收集器等构成，其中色谱柱是色谱分离装置的关键部件。 如图 流动相供给装置 一般包括贮液罐、高压泵、液体混合室及梯度洗脱系统。 高压泵是流动相供给的关键设备。 柱 材料：常用玻璃柱 装柱的好坏对分离效果有很大的影响。（一次加完，平衡） 检测器与流分收集器 在线检测 流分收集器是将底部流出的液体，每次按一定量分别收集的仪器，有滴数式、容量式、