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特殊磷脂酶产生菌的筛选研究总结报告 摘要：磷脂酶A1是专一水解天然磷脂sn一1位酰基的酶，可以得到Sn-2~基溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶在商业上可用于在炼油过程(油脱胶)磷脂的去除。本研究从土样采集环节即针对磷脂酶酶的特点，选择特异性生境（油菜、花生等富含脂质的根际土壤或豆腐乳等）进行土壤采集，依据细菌、放线菌、真菌的特点分别设置适宜的培养条件进行目标菌株筛选，并采用平板透明圈法以及溴甲酚紫显色法建立筛选模型，对初筛性能优秀的菌株，进行复筛。 关键词：磷脂酶A1；初筛；复筛；GPC 引言 磷脂酶是脂肪酶的一种，同时具有脂肪酶活性和磷脂酶活性，但是在一定的反应体系中，会优先表现出一种特定的酶活，磷脂酶可以催化酯交换、酯转移、水解等反应，对磷脂的结构进行各种改变或修饰，得到不同结构和用途的磷脂，所以在油脂工业中广泛应用。磷脂酶A1(PLA1，EC 3．1．1．32)催化磷脂第一位酯酰键的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸，在工业上主要用于食品和非食品的磷脂乳化剂的修饰，增加油／水混合物的乳化以及植物油脱胶等。同传统的脱胶方法相比，酶法脱胶可大大节约化学物质的消耗量，几乎不产生废水，是一种经济节约、高效稳定、绿色环保的具有国际领先水平的油脂脱胶方法。PLA1在烘焙应用中对于提高生面团或烘焙产品质量特别有用。此外，PLA1水解卵磷脂的产物甘油磷酸胆碱具有调节多种细胞机制的生理功能，因而引起人们特殊的研究兴趣。本研究从土样采集环节即针对磷脂酶酶的特点，选择特异性生境（大豆、油菜、花生等富含脂质的根际土壤或炼油厂周边的土壤）进行土壤采集，依据细菌、放线菌、真菌的特点分别设置适宜的培养条件进行目标菌株筛选，并采用平板透明圈法以及溴甲酚紫显色法建立筛选模型，对初筛性能优秀的菌株，模拟实际生产过程，用非水相反应体系进行复筛。 1.土样的采取 针对磷脂酶的特点，为了提高获得磷脂酶的可能性，我们组采用的是花生地，菜园地，油菜地的土壤以及豆腐乳来做筛选。以下是我们组做过的土壤及数量： 花生地土壤 一份 菜园地土壤 两份 油菜地土壤 两份（混合在一起做的） 豆腐乳 三块 2.菌株的分离纯化 2.1 培养基的制备 NA（分离细菌：加入放线菌酮以抑制真菌生长）：(w/v)牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1.0%，NaCl 0.5 %，琼脂 2.0%，pH 7.2； 高氏一号（分离放线菌：加入放线菌酮以抑制真菌生长）：(w/v) KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeSO4·7H2O 0.001 %，琼脂 2.0%，pH 7.2； PDA（分离真菌：加入青霉素以抑制细菌生长）：(w/v)马铃薯20.0%，葡萄糖2.0%，琼脂2.0%；(注：因为土豆培养基的制备比较麻烦，后面我们使用的是买来的孟加拉红培养基） 2.2 分离纯化结果 土壤 分类 数量 注释说明 花生地 细菌 32株 真菌培养基被长毛的真菌覆盖，导致分离困难；并且初次实验没有经验，分离的菌株没有保存。 放线菌 27株 真菌 19株 菜园地 土壤Ⅰ（细菌） 51株 文献表明产生菌多为细菌，并且我们操作还不够娴熟，所以只分离了细菌 土壤Ⅱ（细菌） 49株 油菜地 细菌 32株 3月份采取的土壤，天气还比较寒冷，所以菌的数量比较少；真菌几乎没有 放线菌 17株 真菌 13株 豆腐乳（三块） 细菌 3株 豆腐乳只长出了细菌，并且细菌的形态都一样，所以每块豆腐乳取了一个细菌 放线菌分离纯化图片 细菌分离纯化图片 真菌分离纯化图片 3.产生菌的初筛 3.1初筛第一步 将纯化的待筛菌株接种于筛选培养基上（原培养基的碳源和氮源均改为大豆卵磷脂），培养基配方如下： 细菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂 1.0%，NaNO3 1.0%，K2HPO4·3H2O 0.4%，MgSO4·7H2O 0.06%，琼脂 2.0%，pH 7.2； 放线菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeSO4·7H2O 0.001 %，，琼脂 2.0%，pH 7.2； 真菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，(NH4)2SO4 0.2%，NaH2PO4·H2O 0.05%， K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2 0.10%，琼脂 2.0%，pH 7.2； 初筛第一步结果如下： 产生菌来源 分类 数量 注释说明 花生地 细菌 16株