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特殊磷脂酶产生菌的筛选研究总结报告
摘要:磷脂酶A1是专一水解天然磷脂sn一1位酰基的酶,可以得到Sn-2~基溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶在商业上可用于在炼油过程(油脱胶)磷脂的去除。本研究从土样采集环节即针对磷脂酶酶的特点,选择特异性生境(油菜、花生等富含脂质的根际土壤或豆腐乳等)进行土壤采集,依据细菌、放线菌、真菌的特点分别设置适宜的培养条件进行目标菌株筛选,并采用平板透明圈法以及溴甲酚紫显色法建立筛选模型,对初筛性能优秀的菌株,进行复筛。
关键词:磷脂酶A1;初筛;复筛;GPC
引言
磷脂酶是脂肪酶的一种,同时具有脂肪酶活性和磷脂酶活性,但是在一定的反应体系中,会优先表现出一种特定的酶活,磷脂酶可以催化酯交换、酯转移、水解等反应,对磷脂的结构进行各种改变或修饰,得到不同结构和用途的磷脂,所以在油脂工业中广泛应用。磷脂酶A1(PLA1,EC 3.1.1.32)催化磷脂第一位酯酰键的水解,生成溶血磷脂和脂肪酸,在工业上主要用于食品和非食品的磷脂乳化剂的修饰,增加油/水混合物的乳化以及植物油脱胶等。同传统的脱胶方法相比,酶法脱胶可大大节约化学物质的消耗量,几乎不产生废水,是一种经济节约、高效稳定、绿色环保的具有国际领先水平的油脂脱胶方法。PLA1在烘焙应用中对于提高生面团或烘焙产品质量特别有用。此外,PLA1水解卵磷脂的产物甘油磷酸胆碱具有调节多种细胞机制的生理功能,因而引起人们特殊的研究兴趣。本研究从土样采集环节即针对磷脂酶酶的特点,选择特异性生境(大豆、油菜、花生等富含脂质的根际土壤或炼油厂周边的土壤)进行土壤采集,依据细菌、放线菌、真菌的特点分别设置适宜的培养条件进行目标菌株筛选,并采用平板透明圈法以及溴甲酚紫显色法建立筛选模型,对初筛性能优秀的菌株,模拟实际生产过程,用非水相反应体系进行复筛。
1.土样的采取
针对磷脂酶的特点,为了提高获得磷脂酶的可能性,我们组采用的是花生地,菜园地,油菜地的土壤以及豆腐乳来做筛选。以下是我们组做过的土壤及数量:
花生地土壤 一份 菜园地土壤 两份 油菜地土壤 两份(混合在一起做的) 豆腐乳 三块
2.菌株的分离纯化
2.1 培养基的制备
NA(分离细菌:加入放线菌酮以抑制真菌生长):(w/v)牛肉膏 0.5%,蛋白胨 1.0%,NaCl 0.5 %,琼脂 2.0%,pH 7.2;
高氏一号(分离放线菌:加入放线菌酮以抑制真菌生长):(w/v) KNO3 0.1%,K2HPO4·3H2O 0.05%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05 %,FeSO4·7H2O 0.001 %,琼脂 2.0%,pH 7.2;
PDA(分离真菌:加入青霉素以抑制细菌生长):(w/v)马铃薯20.0%,葡萄糖2.0%,琼脂2.0%;(注:因为土豆培养基的制备比较麻烦,后面我们使用的是买来的孟加拉红培养基)
2.2 分离纯化结果
土壤 分类 数量 注释说明
花生地 细菌
32株 真菌培养基被长毛的真菌覆盖,导致分离困难;并且初次实验没有经验,分离的菌株没有保存。 放线菌
27株 真菌
19株
菜园地 土壤Ⅰ(细菌) 51株 文献表明产生菌多为细菌,并且我们操作还不够娴熟,所以只分离了细菌 土壤Ⅱ(细菌) 49株
油菜地 细菌
32株 3月份采取的土壤,天气还比较寒冷,所以菌的数量比较少;真菌几乎没有 放线菌
17株 真菌
13株
豆腐乳(三块)
细菌
3株 豆腐乳只长出了细菌,并且细菌的形态都一样,所以每块豆腐乳取了一个细菌
放线菌分离纯化图片
细菌分离纯化图片
真菌分离纯化图片
3.产生菌的初筛
3.1初筛第一步
将纯化的待筛菌株接种于筛选培养基上(原培养基的碳源和氮源均改为大豆卵磷脂),培养基配方如下:
细菌筛选培养基:(w/v) 大豆卵磷脂 1.0%,NaNO3 1.0%,K2HPO4·3H2O 0.4%,MgSO4·7H2O 0.06%,琼脂 2.0%,pH 7.2;
放线菌筛选培养基:(w/v) 大豆卵磷脂1.0%,KNO3 0.1%,K2HPO4·3H2O 0.05%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05 %,FeSO4·7H2O 0.001 %,,琼脂 2.0%,pH 7.2;
真菌筛选培养基:(w/v) 大豆卵磷脂1.0%,(NH4)2SO4 0.2%,NaH2PO4·H2O 0.05%, K2HPO4·3H2O 0.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,CaCl2 0.10%,琼脂 2.0%,pH 7.2;
初筛第一步结果如下:
产生菌来源 分类 数量 注释说明 花生地 细菌 16株
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