分子生物学PBL-基因表达检测分析报告.ppt

四、检测p53基因的表达： 根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶，取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳45－60min。成像系统成像分析。 琼脂糖凝胶电泳分离产物： 电泳结果分析 M 1 2 3 M：Marker 1: cDNA 2: 假阳性对照 3：假阴性对照 Thank you! p53基因表达检测 ——RT-PCR 基因表达的检测 1.DNA水平 2.mRNA水平 3.蛋白质水平 Northern 印记杂交 RT-PCR …… RT-RNA （Reverse Transcription RNA） 反转录PCR是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。 mRNA反转录生成的 cDNA 可作为 PCR 的模板进行扩增，这种在 mRNA 反转录后进行的 PCR 扩增称为 RT-PCR 。 Reverse Transcription PCR RNA提取 cDNA 反转录 PCR Northern 印记杂交 基因表达分析 Northern印记杂交 基因表达水平 随机六核苷酸引物引导 Oligo(dT)引导 特异性引导 1． 随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。 3． 特异性引物：用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 * 反转录可用的引物 四个问题 1 2 3 4 在GenBank查找p53基因序列 根据基因序列设计引物 确定RT-PCR的参数 检测 p53基因在血细胞中的表达情况 一、查找p53序列 p53基因的序列 （AF136270.1） 使用Genbank /genbank 引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 二、?如何设计引物？ 引物设计的一般原则： a.长度及碱基分布 引物长度一般为10-30个核苷酸 四种碱基的分布应遵循随机原则 G+C含量一般为40%-60% b.引物之间及引物自身 两种引物间不应有互补性 一对引物间不应有多于四个连续碱基互补 引物自身不应存在互补序列 c.引物3’端 不能进行任何修饰 不能有形成任何二级结构的可能 3’端尽量避免为T d.引物5’端 5’端无严格限制 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0， Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。 Primer?Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer?Design），酶切分析窗口（Restriction?Sites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引物设计功能。 Primer?Premier5.0 启动界面 在此输入需扩增的DNA序列 Hairpin：发夹结构 Dimer：二聚体 False Priming：错配 Cross Dimer： 交叉二聚体 保存 选择满意的引物 所选引物 使用PDF虚拟打印 三、RT-PCR参数的设定 cDNA size: 421 bp 反应程序： 变性 94度 30秒， 退火55度 45秒， 延伸 72度 60秒， 27个循环. 变性：模板DNA由双链变成单链，有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，一般情况下94?C 30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性。 退火：变性的DNA快速冷却至40－60?C可使引物和模板DNA发生结合。可根据引物的长度和G＋C的含量选择复性温度。 循环条件的设定： 延伸：一般是70－75?C，此时Taq DNA聚合酶活性最高。1kb，1分钟；1kb的可适当延长时间。 循环次数：理论上20－25个循环PCR产物的