分子生物学第08章PCR-聚合酶链反应分析报告.ppt

8 PCR－聚合酶链反应 PCR的特点 PCR的基本原理一 PCR的基本原理二 图8－1 PCR的基本原理 PCR反应的体系 PCR仪 对DNA模板的要求 引 物 图8－2 引物5’端外加BamHⅠ酶切 位点掺入产物的两端 引 物 表8－1 引物 5’ 端修饰技术 Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 PCR的反应体系 PCR的反应体系 循环条件的设定 循环条件的设定 嵌套PCR 嵌套PCR提高产物特异性的原理 反向PCR 锚式PCR RACE 锚式PCR扩增已知序列3’侧序列 锚式PCR扩增已知序列5’侧序列 锚式PCR扩增全长的mRNA序列 不对称PCR 定量PCR 定量PCR中的内标 荧光定量PCR TaqMan荧光探针（线性探针） TaqMan荧光探针工作原理 分子信标（环状探针） SYBR荧光染料 荧光定量PCR仪光路图 PCR产物与载体的连接 PCR产物与载体的A-T连接 mRNA差别显示 利用PCR的定点突变 利用PCR的定点突变 利用PCR的定点突变 分子信标荧光探针的设计与TaqMan荧光探针相似，只不过探针的5’端和3’端的一小段序列被设计成互补的，探针没有与靶序列杂交时会形成茎环结构，R基团和Q基团靠近，不能产生荧光。当分子信标与靶序列杂交时，茎环结构被展开，使得R 基团和Q基团分开足够远，Q基团对R基团的荧光淬灭作用消失。余同前。 在PCR反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链中，产生荧光信号，而不掺入DNA双链中的SYBR荧光染料不会发出荧光。这样荧光强度就与双链DNA的量成正比。 解决办法： 用T4 DNA聚合酶除去PCR产物3’端多余的核苷酸，成为平端后连接。 给平端载体的两个3’端各加上一个T，使其与3’A突出的PCR产物互补，然后连接。 Taq DNA聚合酶的扩增产物往往不是平端，而是在双链DNA产物的两个3’端再加上一个非模板来源的核苷酸，A的可能最大，这样有碍于平端的连接。 * 8.1 PCR 的基本原理 8.2 PCR 条件的优化 8.3 由基本 PCR 扩展的相关技术及其应用 聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种体外扩增DNA片段的方法，与用载体和宿主细胞的体内扩增相比，有简便、快速的优点，并有许多特殊的用处。 DNA模板 一对引物 耐热的DNA聚合酶 4×dNTP 缓冲液 Mg2+、K+离子 酶活性保护剂 PCR仪实际上就是一种温度循环仪，它能够快速地升降温和保持恒温，全部由电脑控制。常用的反应容器有0.2ml的薄壁Eppendorf管和毛细玻璃管。 对DNA模板纯度的要求不很高，但必须除去DNA聚合酶抑制剂。理论上有一个DNA模板分子就可以扩增出大量的产物，实际上使用pg~ng级的模板量。模板一般是双链分子，也可以是单链分子。模板DNA分子不宜太长，可用切点稀少的限制酶切成较短的片段。由于环状DNA模板的扩增效率较线状DNA模板低，所以最好先将环状DNA用限制酶切成线状再行扩增。 RNA模板应先逆转录成cDNA再进行PCR扩增。 长度一般为15~30个核苷酸。引物太短与模板结合的位点特异性差，引物太长与模板结合的速率下降，影响PCR的效率。 不应有超过3个连续的C或G。引物自身不存在互补序列，两个引物之间也不能有超过4个连续碱基互补的情况。 当引物的3’端有足够长与模板互补的序列时，引物的5’端可以不与模板互补，利用这点可在PCR产物的两端加上特殊序列（如限制性内切酶位点）。 为了方便PCR产物的检测和分析，可以在引物的5’端以同位素或非同位素修饰（32P、荧光素、生物素等）。 当要扩增的DNA序列不知，但知其编码的氨基酸序列，可反推出DNA序列，为设计引物提供依据。因简并密码的存在，反推出的DNA序列是不唯一的，这时应采用简并引物。 检测 酶 检测，纯化 荧光素 产物纯化，检测 蛋白质结合序列 检测，纯化，定量 生物素 测序，合成RNA探针等 噬菌体启动子 检测，定量 同位素(35S, 32P) 便于克隆等 酶切位点 2.功能基因修饰 1.附加核酸序列 用途 修饰法 用途 修饰法 现在常用的Taq酶，在95℃的变性温度下（20秒），经过50次循环仍保持65 %的酶活性。对于Taq酶的聚合酶活性来说，最佳作用温度为75~80℃，60℃时聚合酶活性仅剩1/2，37℃时聚合酶活性仅剩1/10。但在许多情况下，需要在低于最适温度条件下进行聚合反应，以免引物从模板上解离下来。 Taq酶有5’→3’的聚合活性和5’→3’的外切活性，但缺少3’→5’的外切活