刘中成--细胞凋亡分析报告.ppt

第一部分　概 述 1.?? 凋亡概念的形成和形态学的研究(1972） 1972年Kerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。 Kerr 等在研究肝缺血时注意到两种不同的细胞死亡形式。第一种,细胞膜解体、细胞器形态改变、溶酶体消失即坏死, 而第二种则细胞膜完整、细胞器形态完整、染色质固缩、核碎裂。细胞最终自行分割为若干外膜完整的小体。 Kerr根据这些表现套用希腊语描写树叶凋落的名词apoptosis(凋亡) (apo: away, from 离开; ptosis: falling 落下) 来命名这种细胞死亡形式。 2、研究简史 　　半个世纪前:人们就观察到在生物的发生、生长、发育以及衰老过程中，一直伴随着组织细胞的生理自发退化死亡现象. 1965年:发育生物学家Lockshin和Williams首先提出了PCD（程序化死亡）一词，用于描述蛾的发育过程，认为随着成年蛾的出现，其幼虫死亡是一种发育调节性死亡。 Kerr等根据绝大部分哺乳类动物细胞的程序性死亡过程中其超微结构改变与凋亡相似,认为所有程序性死亡都是通过凋亡实现的。他们这一假设后来被广泛接受。 另外一些学者认为程序性细胞死亡是一种由细胞特定基因调控的细胞自杀过程, 是功能性概念, 而细胞凋亡是形态学概念。 细胞的主动性死亡都同时符合程序性细胞死亡和细胞凋亡的定义, 以致许多学者把凋亡及程序性死亡两个名词等同使用。 三、细胞凋亡与药物研制开发及疾病的治疗 利用细胞凋亡的相关基因研究，开展基因治疗、研究开发基因治疗 利用细胞凋亡的生化机制开展生物制剂研究开发生物制品 利用细胞凋亡研究中细胞因子或细胞保护因子开发新药 细胞凋亡研究中注重无机离子、无机化合物的研究可开发出新药 参与细胞凋亡的受体的研究，开发受体激动性或拮抗性药物 Bcl-2家族 （B cell lymphoma/leukemia-2）B细胞淋巴瘤/白血病-2)Bc1-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡,而不是促进细胞的增殖 。 分布：线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜 Bcl-2家族已发现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个BH结构域。蛋白含有4个Bcl-2同源结构域，依次命 名为BHl、BH2、BH3和BH4。 可分为3个亚族： Bcl-2亚家族： Bcl-2 Bcl-xl Bcl-w、Mcl-1、A1。 Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起抑制作用 Bax亚家族：Bax、Bak、Bok，它们的作用与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 BH3亚家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；仅有BH3结构域。它们的作用也与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 作用机制：影响APAF1的功能 影响线粒体的结构与功能 1 光学显微镜和倒置显微镜 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。 荧光显微镜观察 fluorescent microscope ? Hoechst33258, Hoechst33342,均为DNA特异性染料，与AT键结合，在pH2.0时优先与RNA结合，染色DNA时应调pH7.0。 染料不溶于磷酸缓冲液，所以配制时先必须用蒸馏水溶解，4℃避光保存。 染料对死细胞或70％冷乙醇处理的细胞可立即染色，对活细胞的染色是渐进的，在10min内可达到饱和。 电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 流式细胞仪检测 flow cytometer （一）PI 单染 （二） Hoechst33342 / PI双染色 （三）Annexinⅴ/ PI双染色 流式细胞仪 flow cytometer荧光激活细胞分类器 fluorescent activated cell sorter, FACS ?Hoechst33342是双苯并咪唑家族成员，能特异性与DNA螺旋小沟中AT结合。它能被活细胞摄入，也能在摄入后被细胞排出。 活细胞对碘化丙锭（PI），溴化乙锭（EB）有拒染性，当细胞被这些染料着染，提示为晚期凋亡或坏死。 （一） PI 单染  细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞