常见PCR方法整理..docx

PCR的一般流程（以Taq DNA聚合酶为例）试剂和仪器1、仪器：PCR仪、移液器、离心管和枪头（121℃灭菌20min，烘干）、冰盒、板架、离心机。2.ddH2O：三蒸水121℃灭菌20min，4℃保存；3.Buffer：含Mg2+，10×，-20℃保存；4.dNTP：保存液为25mM，使用前用ddH2O稀释为2.5mM并分装，避免污染，-20℃保存。5.引物：引物干粉在溶解前先12,000rpm离心2min，再用ddH2O溶解至10μM，涡旋震荡使其充分溶解，-20℃保存；6.模板。7.Taq DNA聚合酶：-20℃保存。实验准备1.预订PCR仪，填写好使用时间；2.制冰；3.将所需试剂解冻、混匀、瞬离，置于冰上，模板要放在冰上解冻。步骤：1.设计实验，认真阅读相关试剂说明书。2.将离心管置于冰上，按照如下体系加入样品。加样顺序为：ddH2O→Buffer/dNTP/引物/模板。Taq DNA聚合酶反应体系（25μL）试剂用量（μL）ddH2O18.375μLBuffer （Mg2+，10×）2.5μLdNTP（2.5mM）2μL引物（正向和反向，10μM）各0.5μL模板DNA102~105copiesTaq DNA聚合酶*0.125μL* 注意：加酶之前将酶拿出放冰上，使用完立即放回冰箱。3.在离心管盖上写好每个样品的编号，瞬离。4.设置好PCR程序，待反应温度达到实验需要时，将样品放入PCR仪，尽量放在中央的孔。5.将试剂放回原处，移液器调回最大量程，整理实验台。6.反应结束后，及时停止PCR程序（不要停在4℃太久），取出样品，关好PCR仪。四、 其它注意事项：1.正确使用移液器、离心机和PCR仪；2.手或移液器不要接触反应管或试剂瓶、管的内壁、盖内侧；3.不使用枪头时，盖好枪头盒盖；4.枪头只能使用一次；5.合理设计实验，使用适当的阴性对照很重要，如：使用不加DNA的材料进行PCR扩增，以证明缓冲液或其他试剂中是否存在任何可影响PCR的污染物；6.如果一次实验需做多管样品，尽量先配制mix，由于存在液体混合后的体积变化和挂液，计算mix用量要比实际管数多一些；7.反应在PCR仪进行期间，最好能检查一下程序是否在正常运行，及时发现异常。3.2 移液器的使用方法1.调节量程：轻轻旋转量程调节圈，注意不要超过量程。建议从高到低调节量程，必要时，可旋转量程调节圈稍超过所需数值，再向回旋转，移液可以更准确。2.装配枪头：轻轻按压，将枪头盒上的枪头装配到移液器。3.吸液：按下操作键至一档（设定体积），将枪头垂直浸入液体约4mm；让操作键慢慢复位，此过程中保持枪头浸入深度，防止吸入空气；将枪头慢慢移出液面，并确保枪头外壁无残留液体。（建议每个新枪头先经过一到三次的吸液和放液来润湿，有助于提高移液准确度。吸取大体积液体时，将枪头保持浸入状态约3秒钟，再移液。）AB图3.2.1 移液器的吸液（A）和放液（B）4.放液：将枪头倾斜地紧贴管壁，将操作键慢慢按向一档（设定体积），等待，直到不再有液体流出；将操作键按向二档（吹液），将枪头完全排空；仍然按住操作键，在管壁上擦拭枪头；在管外，慢慢让操作键复位；按下脱卸键卸掉枪头。5.其它注意事项：（1）轻拿轻放，使用后调回最大量程；（2）保持移液器洁净。（3）与水有很大物理性差异的溶液，或在移液器枪头和液体间存在很大温差的溶液，可能会导致移液不准，要注意检查移液体积。3.3 PCR反应原理及过程3.3.1 反应原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链（图3.3.1）。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。3.5.2 反应过程PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成（图3.3.2）：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成