（精）病理实验技术.ppt

病理实验技术 吴长德 沈阳农业大学畜牧兽医学院 病理学发展史 病理学的发展与使用的工具和方法的更新密切相关。 用解剖刀剪进行尸体检查，开展了器官病理学； 显微镜发明百年之后，建立了细胞病理学； 20世纪电子显微镜的问世，发展了超微病理学； 免疫组织化学促进了免疫病理学的形成； 当前计算机和网络的应用，使病理学走向了信息病理学时代。 因此，病理学经历了大体器官病理学、细胞病理学、超微病理学、免疫病理学和分子病理学的发展阶段，正在向21世纪的信息病理学前进。 “技术是病理学之母”; “病理学的理论和技术被视为一辆车的两个车轮.缺一不可,互为依存,互相促进,两者的结合决定着病理学的发展 .”(第三军医大学程天民院士) 病理解剖的意义 验证临床诊断的正确性及治疗效果 发现临床诊断和治疗上存在的问题，实现病理和临床的交流与统一。 病理组织学 病理组织切片的制作 病理组织的取材 病理组织的固定 病理组织切片技术 取材的重要性 病理标本的检查应包括大体和显微镜下观察两个方面，而正确的诊断往往取决于准确的显微镜下观察，因此制片质量的好坏将直接影响诊断结果的准确性，甚至会带来错误的结果。 一张好的切片与取材和固定都有密切的关系。对于免疫组织化学方法所需材料的取材，不仅要求组织细胞的形态完整保存，而且要最大程度的保存组织或细胞成分的抗原性。 取材 确定取材的部位和块数 编号或标记 固定　 摄影，并编号存档 取材时注意事项 1.注意防止人为因素的影响 2.标本大小 3.取材时间 4.注意包埋方向 5.边缘标记 6.小标本的处理方法 7注意特殊情况 8.取材数量 9.清除多余成分 10.重复取材 11.核对 12.组织存放 冰冻切片取材 应取2块或更多组织块，如有特殊包埋面，应向技术人员说明． 取材后应立即用液氮速冻，－70℃或－40℃低温冰箱保存。 制作冰冻切片的同一块组织（“冰对”）及其剩余组织（“冰剩”，“冰余”）须进一步做常规石蜡切片进行对照，尤以“冰对”为重要，一方面可能因为病灶小，可能全部取在冰冻组织块中，另一方面有利于病理医师对照阅片，不断提高观察冰冻切片的能力 活检组织取材 多用于临床肿瘤组织，除前面讲到的各点注意事项外，还应注意肿瘤的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的关系，包膜是否完整．肿瘤的体积（长、宽、高），甚至重量。 对肝肾穿刺的标本，潮湿 的纱布、青霉素小瓶、固定液等 细胞标本的取材 细胞标本取材和制片方法一般有 1 印片法 2 穿刺法 3 沉淀法 4 活细胞标本的制备 1.印片法 常用于活检和手术标本，新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载片上，吹干后将其立即浸人固定液内5～10min，取出自然干燥，低温储存。 2.穿刺法 常用于淋巴结、软组织、肝、肾和肺等，穿刺液少，可直接涂在载片上，细胞尽量涂均匀。 3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿液和脑脊液等体液多而细胞少的标本。 4.活细胞标本的制备 多用于科研，用于常规病理诊断的较少。 标本主要来源于建株的培养细胞、短期培养细胞和外周血等。 细胞可直接培养在盖玻片上，固定后即可进行染色观察或进行免疫组织化学染色或扫描电镜标本制备。也可培养于培养瓶或培养板内，制成细胞悬液，收集一定的细胞还可进行涂片。可以经离心后，进行透射电镜标本制备。 组织固定方法  固定的意义 ： ①保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。 ②保持细胞内特殊的成分与生活状态时相仿：经过固定，细胞内的一些蛋白质等可沉淀或凝固，使其定位在细胞内的原有部位，有利于其后物质的确切定位。对于不同的物质应选用不同的固定剂和固定方法． ③便于区别不同组织成分：组织细胞内的不同物质经固定后产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别。 ④有利于切片：固定剂有硬化作用，使组织硬度增加，便于制片 固定液种类 甲醛；40%甲醛：水=1：9 4%的甲醛：10福尔马林 渗透力强，固定均匀，对组织收缩小，具有硬化和防腐的作用，但破坏血红素，使之失去原有颜色。 重铬酸钾水溶液（1-3%）； 苦味酸(饱和水溶液)； 升汞（5-7%）； 醋酸水溶液（0.3-5%）； 铬酸水溶液（0.5-1%）； 锇酸水溶液（1-2%）； 丙酮、三氯醋酸、酒精（80-95%）等。 混合固定液（如Altmamn液；B-5固定液；Carmoy液。 固定时注意事项  固定液的量：4-5到15-20倍 固定时间：24小时以上 组织块大小：3-4毫米厚 固定温度：常温25度，低温4度 组织速冻方法 组织速冻的方法 ①液氮法 ②干冰－丙酮法 ③异戊烷－液氮法