基因组学第8章教案分析.ppt

第8章干扰小RNA--small RNA 山上有奇峰, 深藏云雾中. 平时看不见, 偶尔露峥嵘. 干扰小RNA是如何发现的 三条路线, 殊途同归: 1) 植物转基因沉默 2) 线虫RNA注射实验 3) 线虫发育突变研究 植物转基因沉默 1989年Matzke等为了加深矮牵牛花瓣的颜色将控制紫色花的基因导入矮牵牛细胞,并获得再生植株.未曾预料的是,在转基因阳性植株中出现完全为白色花瓣的植株. 深入研究发现, 导入矮牵牛的转基因含有反向尾--尾重复的结构. 产生正义和反义基因转录产物.正义和反义基因转录产物形成dsRNA, 导致内源基因的沉默,使原本产生紫色花色的花瓣变成白色. 这是首次报道正反义双链RNA导致的内源基因沉默. 线虫双链RNA分子导致的基因沉默 1995年Cornell大学的研究人员Guo和Kemphues在研究阻断秀丽新小杆线虫中的par-1基因时，利用反义RNA (antisense RNA)技术特异性地阻断par-1基因的表达，同时在对照实验注射正义RNA（sense RNA）观察基因表达是否增强。但结果是二者都同样地切断了par-1 基因的表达途径,这与传统的反义RNA功能的解释自相矛盾，作者对此未能给出合理解释。直到1998年2月，Fire和Mello首次揭开谜底。他们证实，Guo等报道的正义RNA抑制基因表达的现象是由于实验中污染了微量双链RNA (Double RNA, dsRNA)所致。他们将体外转录的单链RNA纯化后注射线虫，发现基因抑制效果十分微弱。而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断靶基因的表达，其效率高于单链反义RNA约2个数量级。 Fire等对dsRNA调控内源基因表达的现象创造了一个名词: RNA interference, 简称RNAi, 即RNA干扰. 线虫发育突变与小分子RNA 上世代70年代中期，悉尼Brenner实验室发现了lin-4突变体。1988年夏，Abros小组开始克隆lin-4基因。他们获得了一段700bp长的cDNA，但未发现ORF。将lin-4的700bp进行移码突变，结果也未能使其失去原有功能。这使他们认识到，lin-4可能是非编RNA。 与此同时，另一个小组Ruvkun实验室也获得一个类似lin-4表型的突变，并采用定位技术将lin-14的突变确定在lin-14的3’末端。他们发现，lin-4和LIN-14的3’末端有多处互补序列。由此他们认为，lin-4基因的适时表达可以使lin-14基因沉默，使线虫发育进入L2期。 2000年，采用定位克隆技术发现另一个miRNA基因let-7. Let-7可以使lin-41基因沉默，let-7和lin-41在物种间有很强的保守性。这些小RNA被称为“small temporal RNA”（stRNA）。自let-7非编码小RNA可调控基因表达后, ncRNA的生物学才引起广泛关注. lin-4miRNA和let-7miRNA的功能 线虫Let-7突变剖析 let-7与靶基因mRNA的互作 单个miRNA可识别多个mRNA靶标, 一个mRNA靶标可被 多个miRNA识别. lin-4miRNA和let-7miRNA干扰的靶mRMA miRNA与靶mRNA之间有多种互作方式. 见: Nature 403:901-905, 2000 两种调控小分子RNA—miRNA和siRNA 根据小分子RNA的来源及其加工方式,可将其分为两大类: 1) siRNA(short interfering RNA):小分子干扰RNA, 主要来源于内源转座子,反向重复DNA,转基因表达产物,外源病毒等. 2) miRNA(microRNA): 微小RNA, 主要来源于pre-mRNA. 到2005年，在12个物种中共报道了2953个miRNA: 线虫,114; 果蝇: 78; 斑马鱼(Danio rerio ), 369; 鸡, 122; 拟南芥, 117; 人类, 328; 小鼠, 224; 大鼠, 186. miRNA的加工及普遍结构 动物miRNA基因的结构与分布 动物miRNA基因属于 PolII基因,加帽与加 尾,有三种分布方式: 1)独立结构 2)内含子中 3)外显子中 4)3’UTR 人类基因组约50% miRNA 基因成簇状排列。 人类多顺反子miRNA基因多呈簇集分布 动物miRNA的加工机制 成熟miRNA的3’末端有2nt的突出. 动物miRNA的功能 根据miRNA保守的5’端“种子”顺序同源性有哪些信誉好的足球投注网站,推测人类基因组中约三分之二的蛋白质编码基因受miRNA的调控. 已知所有动物miRNA作用