国内外柑桔黄龙病发生及其监控技术教案分析.ppt

柑桔黄龙病（HLB）与柑桔木虱监测控制技术 重庆大学生物工程学院 主要内容 1. 国内外柑桔黄龙病发生为害现状 2. 柑桔黄龙病常规鉴定方法 3. 柑桔黄龙病分子检验技术 4. 柑桔木虱监控技术 5. 柑桔黄龙病综合防除 1.国内外柑桔黄龙病发生与研究 柑桔黄龙病（Citrus Huanglongbing Disease） 柑桔黄龙病是国内外柑桔产业头号重大检疫性病害 柑桔黄龙病是由难人工培养的韧皮杆菌所引起，目前已报道三种 亚洲韧皮部杆菌(Liberibacter asiaticus) （亚洲黄龙病菌） 非洲韧皮部杆菌(L. africanus) （非洲黄龙病菌） 美洲韧皮部杆菌（L. americanus) （美洲黄龙病菌） 由柑桔木虱（Diaphorina citri）取食新梢，嫁接带菌接穗在田间传播， 随带病（虫）种苗的调运而远距离传播。 受全球性气候变暖和局部省区暖冬气候气候影响，传病虫媒的越冬北界呈现逐年北移的趋势； 随作我国柑桔产业的迅速发展，带病（虫）柑桔种苗的私调乱引案例增多，导致南方部分省区柑桔黄龙病发生面积呈现逐年扩大的趋势。 美国柑桔黄龙病研究现状 美国9个州发现柑桔木虱； 美国佛罗里达、路易斯安那州发现黄龙病； 发现黄龙病菌的人工培养需要柑桔体内的一种放线菌的参与； 主要为亚洲韧皮杆菌和美洲韧皮杆菌； 柑桔黄龙病菌基因组测序接近尾声，即将发表（估计大小为1.3～1.8Mb）； 柑桔黄龙病的病原菌不只一种:三种韧皮杆菌Las、Laf、Lam/柑桔植原体； HLB的国内外分布 柑桔黄龙病(Citrus Huanglongbing Disease，HLB) 主要发生于亚洲，非洲和南美洲的40多个国家； 国外主要分布于东南亚、南非、东非、阿拉伯半岛及留尼旺岛、毛里求斯、马达加斯和南美； 巴西柑桔主要柑桔产地发现黄龙病； 2005年美国Florida发现柑桔黄龙病； 我国最早发生在广东省汕头地区，全国柑桔产区11个省市有黄龙病。 世界柑桔黄龙病起源与扩散途径 三种柑桔黄龙病菌的世界分布 美国佛州HLB分布图 中国HLB分布概况 2. 柑桔黄龙病常规鉴定方法 黄龙病症状诊断要领 叶片斑驳：首先观察叶脉基部及附近，看是否有不均匀黄化斑块。这些黄化斑块较淡，与周围绿色叶肉分界不象缺锌那么明显，也不象缺锰那样斑块分布均匀。 树冠黄梢：某个部位的枝条叶片黄化，叶脉变黄，叶片易脆。若天牛为害或烂根则全树黄化。 畸形果实：病枝上果实外形歪斜；果内维管组织黄褐色，正常果实则是绿白色；果实种子瘪小，紫褐色有些种子只有种皮，无种仁、种皮紫褐色。 柑桔黄龙病典型症状－叶片斑驳 柑桔黄龙病（HLB）典型症状（1） 柑桔黄龙病不同症状类型 柑桔叶片疑似症状 柑桔黄龙病危害症状 黄龙病田间不同症状表现－I 黄龙病疑似症状类型 疑似柑橘黄龙病（HLB） 症状 PCR检测－除草剂药害  基于靶标生物蛋白质的现代免疫学检测 ELISA、DIA、 现代免疫层析技术：金标法、强化金标法 玻片载体的蛋白芯片技术 基于靶标生物遗传物质的分子检测技术 常规PCR: 单一/多重靶标、 RT－PCR：RNA cDND dsDNA 实时荧光定量PCR：10个拷贝， fg级/ul; 固相化检测试剂盒研制与实际应用 症状识别与分子监测技术 根据病害症状特征识别普查和重点调查： 叶片斑驳 树冠黄梢 果实畸形 监测目的： 为柑桔非疫区检疫性病害早期预警、检疫处理提供试验依据 提高病害诊断准确性，确保无疫区引种苗木的品质。 黄龙病症状诊断要领 叶片斑驳：首先观察叶脉基部及附近，看是否有不均匀黄化斑块。这些黄化斑块较淡，与周围绿色叶肉分界不象缺锌那么明显，也不象缺锰那样斑块分布均匀。 树冠黄梢：某个部位的枝条叶片黄化，叶脉变黄，叶片易脆。若天牛为害或烂根则全树黄化。 畸形果实：病枝上果实外形歪斜；果内维管组织黄褐色，正常果实则是绿白色；果实种子瘪小，紫褐色有些种子只有种皮，无种仁、种皮紫褐色。 3. 柑桔黄龙病分子检验技术 诊断方法与检测技术 常规诊断方法：症状观察； 70年代的免疫电镜诊断：但因菌体在病树内数量少，分布不均，所以检出率不高, 容易漏诊。 80年代利用血清学技术：寄主富积制备单抗，但效价低，并伴有非特异性免疫反应干扰，不能通用，未能普遍应用。 90年代基于特征片段设计引物建立了柑桔黄龙病菌PCR检测技术。 中心的硬件基础 已经建立的分子检测技术体系 柑桔黄龙病 柑桔溃疡病 小麦矮腥黑穗病 马铃薯病毒病 柑桔衰退病 松材线虫 柑桔黄龙病 亚洲柑桔黄龙病病原细菌显微镜形态图 柑桔黄龙病菌常规PCR检测步骤 黄龙病PCR样品制备方法 1. 浸提法：制备待测液 班驳叶片中脉（0.2g/ml, 37℃，15-3