DNA实验计方案-玉米基因组DNA的提取与转基因成分分析.doc

《生化实验技术》实验设计方案 实验项目：玉米基因组DNA的提取与1、掌握提取DNA的基本方法、 4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳。、掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪等仪器设备的使用。核酸是生物有机物体重的重要组成成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起。核酸分为DNA和RNA两大类，前者主要存在于细胞核内，后者要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA则溶于上层水相。将氯仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA的少量溶解。95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可以除一些盐分，经Rnase解RNA，可得较纯的DNA。DNA含量与纯度测定，目前常用紫外吸收法，利用核酸在260nm有吸收峰，根据公式DNA(μg/mL)=A260*50*稀释倍数可计算出核酸DNA的浓度。由于蛋白质在280nm有吸收峰，可根据比值判断DNA纯度：A260／A280＜1.8时，表明蛋白质含量偏高；＜A260／A280＜1.9时，表明样品较纯；A260／A280＞2.0时，表明RNA或DNA碎片较多。 ’-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400ug范围内光吸收值与DNA含量成正比。 在转基因技术中，外源基因导入到植物体中时，通常使用花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子启动下游编码基因的转录。在染色体中，一个转录单位由启动子序列，编码序列和终止序列组成，常用终止序列是胭脂碱合酶（NOS）的编码序列的终止序列。这部分序列相对于被导入植物而言，属于外来基因序列，所以非转基因植株不含该段核苷酸序列。针对CaMV35S启动子或NOS终止子序列进行分析，即可定性分析植株体是否为转基因品种。电泳（electrophoresis）是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。 不同大小、不同形状和不同构象的DNA 分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色，在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。 实验仪器： 离心机冰箱、恒温水浴箱、紫外分光光度计、量筒移液管烧杯、玻璃棒、试管离心管容量瓶2、试剂100μg/mL （三）二苯胺法测DNA含量 ①DNA标准溶液：取标准DNA以0.01mol/L氢氧化钠溶液配成200μg/mL。 ②DNA样品液：（自己提取）控制其DNA含量在50－100微克/毫升左右。 ③二苯胺试剂：称取0.8克二苯胺试剂，溶于180毫升分析纯的冰醋酸中，再加入8毫升过氯酸（A.R，60%以上），混匀备用。临用前加入0.8毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）。所配得的溶液应为无色。 （四）DNA琼脂糖凝胶电泳 ①Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.3：称取10.78gTris，5.50g硼酸，0.93g EDTA-Na2溶于去离子水，定容至1000mL。 ②琼脂糖：1g溶于TBE缓冲液中加热配成100mL。 ③0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液（5×Loading Buffer ）：取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。 ④0.5μg/mL溴化乙啶染色液：称取5mg溴化乙啶，用去离子水溶解，定容至100mL。从中取1mL，用无离子水稀释至100mL。（有毒，戴手套，通风柜内进行。） ⑤DNA Marker (五)PCR扩增CaMV35S启动子，基因Lectin序列 水 10XPCR缓冲液（不含氯化镁） 氯化镁溶液：25 mmol/L dNTP溶液:2.5 mmol/L 引物 6. 正向引物： CaMV35S启动子（Genebank 编号：V00141） 5-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3 反向引物： CaMV35S启动子（Genebank 编号：V00141） 5-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3 7. 正向引物： 玉米IVR基因（Genebank 编号：U16123） 5-CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC T-3 反向引物： 玉米IVR基因（Genebank 编号：U16123） 5-GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C-3 五、实验流程（技术路线）： 六、实验步骤： （一）基因组DNA的提取和纯化 CTAB-1法 称取100mg样品至2ml Eppendorf离心管中，加入70