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硕士学位论文科学学位 NU7441对肝癌HepG2细胞放射增敏效应及其作用机制的研究研究生：王全绪导师：杨川杰副教授专业：内科学二级学院：第二医院2015年4月目录中文摘要…………………………………………………………8英文摘要…………………………………………………………8英文缩写…………………………………………………………10研究论文 NU7441对肝癌HepG2细胞放射增敏效应及其作用机制的研究前言……………………………………………………………12材料与方法……………………………………………………18结果……………………………………………………………30附图……………………………………………………………35附表……………………………………………………………40讨论……………………………………………………………45结论……………………………………………………………50参考文献………………………………………………………53综述DNA依赖性蛋白激酶及其抑制剂与肿瘤治疗的研究进展致谢…………………………………………………………………60个人简历……………………………………………………………62 NU7441对肝癌HepG2细胞放疗增敏效应及其作用机制的研究摘要目的：原发性肝癌（HCC）是一种恶性程度高、治愈率低的临床常见恶性肿瘤，它在全球恶性肿瘤中的发病率居第六位，而病死率居第三位。在发展中国家，病因以乙型肝炎病毒感染为主，而在发达国家，主要与酒精性肝病、肥胖等有关。原发性肝癌的病理类型主要包括肝细胞型、胆管细胞型及混合型，前者占多数。临床上原发性肝癌的主要治疗方法包括手术治疗、化疗、放射治疗、肝动脉化疗栓塞、分子靶向治疗、中医治疗等方法。目前针对肝癌的治疗是个体化的综合治疗。由于早期肝癌的临床症状不明显，因此大部分患者就医时肝癌已处于晚期，失去了手术机会，并且随着肝癌精确放疗的发展，放射治疗已成为晚期肝癌的主要治疗方法之一。放疗无异于电离辐射，当肿瘤细胞受到射线照射后，会发生DNA损伤，细胞如果不能及时精确地修复，继而会诱发细胞的凋亡。然而，肿瘤细胞具有高效的修复机制，在受到电离辐射时，会导致细胞DNA双链断裂，细胞随后启动修复机制，在真核细胞中主要存在两种修复方式：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组(HJ)，在电离辐射引起的DNA损伤中，修复途径以非同源末端连接为主，因此抑制DNA的修复途径有利于促进肿瘤细胞的凋亡，提高肿瘤放射治疗的效果。DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）复合物是非同源末端连接途径的关键组分，且DNA-PKcs作为DNA-PK的催化亚基更是其中的关键蛋白，目前各种DNA-PK抑制剂已用于肿瘤放疗增敏的实验研究。人工合成的小分子化合物 NU7441作为DNA-PK的特异性抑制剂，在乳腺癌、肺癌、白血病、前列腺癌联合放疗的研究中表现出了放射增敏效应。本实验拟应用 NU7441联合放疗作用于肝癌HepG2细胞，对 NU7441的放射增敏效应及其作用机制加以研究，为临床上肝癌放疗增敏剂的开发与应用提供理论指导。方法：通过CCK-8实验检测 NU7441在不同浓度及作用时间下对HepG2细胞增殖的影响，并绘制相应的作用曲线。通过Western blot的方法检测①DNA-PKcs在正常肝细胞LO2、肝癌细胞HepG2细胞及4Gy γ射线照射后的HepG2细胞中的表达情况。② NU7441对4Gy γ射线照射后的HepG2细胞中Ku70、Ku80、DNA-PKcs及pDNA-PKcs(S2056)蛋白表达的影响③ NU7441和另一种放疗增敏剂 NU7026在相同条件对pDNA-PKcs（S2056）蛋白表达的影响通过单细胞凝胶电泳(SCGE)实验及免疫荧光实验检测在 NU7441有无的情况下，4Gy γ射线照射后的HepG2细胞在不同时间点的DNA损伤修复情况通过流式细胞术检测HepG2细胞在对照组（Control）、单纯照射组(IR)、单纯加药药组( NU7441)、加药联合放射组( NU7441+IR)中，作用24h后，比较各组细胞在细胞周期的各时相所占比例。采用统计学软件17.0进行实验数据分析，实验结果用均数±标准差表示。两独立样本采用t检验，多个独立样本的比较采One -Way ANOVA的分析方法，p0.05视为有统计学差异。结果：CCK-8增殖实验表明 NU7441对HepG2细胞的增殖具有一定抑制作用，且具有浓度和时间依赖性， NU7441在浓度为5μmol/L及以上浓度下，这用抑制作用更加明显（P0.05）。Western blot实验表明①DNA-PKcs在LO2细胞、HepG2细胞及4Gy照射后HepG2细胞中的表达依次增高②与对照组相比，在 NU7441作用下，Ku70，Ku80及DNA-PK