RNA提取标准流程RNA提取标准流程.doc

RNA提取标准流程 原理：TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol使样品细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。 预防RNase污染注意事项：1． 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2． 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。3． RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿塑料制品高压灭菌。4． 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.0% v/v，oC放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇oC，用时取出置于冰上），75%乙醇，无RNase的水溶液均需用0.0% DEPC处理过的水配制10×Loading buffer（宝生物工程（大连）有限公司，货号：D603，35元，1mL×5支） 准备器材：1 mL、200 μL枪头、小烧杯*3、1.5 mL管、2 mL管若干、报纸、卷纸、研钵，以上物品全部需要高压。 操作步骤:1. 研磨+匀浆将组织在液氮中磨碎（不均一的样品，如、肾上腺等腺体，必须研磨），50～100 mg组织样品（肝脏可减少样品量到30 mg）放入2 mL离心管中，称重记录每50100 mg组织加入1 mL TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。2．将匀浆样品在室温（1530oC）放置5 min（可延长到15 min），使核酸蛋白复合物完全分离。可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖（如肝脏和肌肉中的糖原）或胞外物质（肌肉）可于28℃ 10000 × g离心10，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量基因组DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液转入2 mL管中进行下一步操作。. 每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡60 s（可使用混匀器，也可手动颠倒混匀），室温放置3 min。（可延长震荡时间和放置时间到15 min，同GTC法）. 4oC 10000 × g离心15。样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（即1mL最多600l，为保证RNA质量，可适量减少抽取量，防止抽到下层）. 记录抽取水相的量，把水相转移到新的1.5 mL管中，用异丙醇沉淀水相中的RNA。a. 每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇，室温放置10。b. 可选：应对糖原含量较高的组织（如肌肉和肝脏）每使用1 mL TRIzol在水相中加0.25 mL异丙醇和0.25 mL高盐溶液0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl混合离心，这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA。. 4oC 10000 × g离心10，离心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝脏等富含糖原的组织可能出现大量糖原沉淀），离心后在管侧和管底出现白色沉淀。弃上清。. 向1.5 mL管中加入75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1 mL TRIzol至少加1 mL 75%乙醇。℃不超过7500×g离心5，弃上清。. 室温放置干燥RNA沉淀，大约晾510 min即可，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入适量DEPC水，记录使用的DEPC水体积（适量是指加入水后仍能保证RNA浓度μg/μL，但不影响溶解，浓度在4 μg/μL以上的RNA较容易出现溶解不完全的情况），使之充分溶解可选择4℃放置1 h以上或5565oC水浴10 min，之后才可以进行测浓度、DNA污染的PCR验证、RNA变性电泳等后续操作。RNA应尽快转移至-70o保存。 也可用100%的去离子甲酰胺溶解用于northern的RNA可这样保存于-20o）。 补充说明：1. 从少量样品（1～10 mg组织或102～104细胞）中提取RNA时可加入少许线性丙烯酰胺等助沉剂以促进RNA沉淀。操作示例：加800 μL TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加浓度为5 mg/mL的线性丙烯酰胺2～3μL RNase-free线性丙烯酰胺溶液。它在使用时最终工作浓度应该为1020 μg/mL。线性丙烯酰胺会与RNA一同沉淀出来，线性丙烯酰胺浓度不高于5 μg/μL不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。线性丙烯酰胺制备方法见附1。2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70o保存至少一个月。3. 若提取的组织内源性RNAase含量较高（如胰腺），可将全部过程置于冰上