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超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法 2009年12月08日 16:17 法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭 ，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。2. 仪器荧光灯管。离心机。分光光度计。pH计。3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。向每支试管加入25~30μL酶液。在25~30下用光强4000lx的荧光灯管（可用15W荧光灯）进行光照，15~20min后，出现颜色变化。停止光照。在560nm波长下比色测量透光度。用未加酶液的反应体系做对照。5. 结果计算以抑制蓝色形成的50%为一个酶活单位。按下式计算：式中 s——样品照光后的透光度；a——未加酶之反应液照光后透光度；b——未加酶之反应液照光前透光度；n——酶液稀释倍数。样品酶活单位表示：SOD酶活单位（U）/g干重（g鲜重或g蛋白）。6. 注释（1）进行照光操作时，应注意所用试管的直径与管壁厚度基本一致。（2）进行比色测定时，应用未加核黄素的酶反应体系液作空白。（二）连苯三酚自氧化法1. 方法提要连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 ，生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间物的积累在滞后30~45s后就与时间成线性关系。中间产物在420nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时由于它能催化 生成O2与H2O2，从而阻止了中间物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。2. 仪器紫外分光光度计。pH计。3. 试剂（1）连苯三酚，K2HPO4·3H2O，KH2PO4，HCl均为分析纯级；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。（2）连苯三酚液：用1×10-2mol/L HCl将之配成浓度5×10-2mol/L连苯三酚液。（3）pH8.3, 5×10-2mol/LK2HPO4- KH2PO4缓冲液。4. 测定步骤（1）酶液的制备：除使用以上K2HPO4- KH2PO4缓冲液外，其他同氮蓝四唑法。（2）连苯三酚自氧化速率的测定：取4.5Ml ph8.3, 5×10-2mol/LK2HPO4- KH2PO4缓冲液，在25水浴中保温15min，加入10μL5×10-2mol/L连苯三酚液，迅速摇匀（空白以K2HPO4- KH2PO4缓冲液代替），倒入光径1cm的比色杯内，在420nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次。计算线形范围内每1min A的增值，此即为连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min左右。（3）酶活测定：测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同，在加入连苯三酚之前，先加入待测SOD酶液，缓冲液减少相应体积。计算加酶后测连苯三酚自氧化速率，按以下公式计算酶活。5. 结果计算样品酶活单位表示同氮蓝四唑法。式中 A420nm/min——酶样品在420nm处每分钟光密度变化值；V——反应液体积：n——酶液稀释倍数。 [原理] 超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，