（精）实验二_SDSPAGE凝胶电泳.ppt

同济大学 周智敏 SDS凝胶电泳 实验原理 实验步骤 注意事项 SDS的优点 SDS的缺点 实验常见问题及处理 小技巧 实验原理 源起 基本原理 分类 分离范围 源起 1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。 他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视. 基本原理之一 阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。 基本原理之二 结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。 这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。 分类 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类. 连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 浓缩胶 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。 浓缩效应之二 　电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 电荷效应之二 　 与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，使得SDS电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。 电荷效应之三 在SDS电泳中，由于SDS这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位，这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS-蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表： 上样缓冲液?之二 注意事项 还原型上样缓冲液中含一定量的DTT（二硫苏糖醇）或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，较易区分； ? 含巯基的试剂有一定的毒性，为了安全和健康，应穿实验服并戴一次性手套操作。 上样缓冲液?之三 使用说明? 1.按每4 μl蛋白样品加入1μl蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。 ????2.?100℃或沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白。 ????3.?冷却到室温后取上清直接上样到SDS胶加样孔内即可。 ????4.?通常电泳时染料到达胶的底端附近（0.5 ～1cm)即可停止电泳。 甲醇/冰醋酸固定液 甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大(可收缩20?左右)，可使材料变硬。 冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用0.3～0.5?的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。 染色剂