（精）分子诊断项目.ppt

分子诊断室项目介绍 内 容 HBV DNA荧光定量PCR PCR技术简介 1985年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室mullis等人发明了具有划时代意义的PCR技术，从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。 1988年PE-cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，从而使PCR技术的自动化成为现实。 Mullis出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变的发明者Michael分享了1993年诺贝尔化学奖。 随着PCR技术的日臻成熟1995年出现荧光基因探针杂交定量PCR方法 PCR基本原理 类似DNA的体内复制，以单链DNA为模板，利用DNA聚合酶依赖于模板的特性，在附加的一对寡核苷酸引物之间催化合成互补链的过程。 DNA 合成的必备要素 DNA Polymerase dNTPs single-stranded template primer 实时荧光定量PCR原理 指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 Ct（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 荧光阈值（threshold)的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即： threshold=10×SD cycle0-15 Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 荧光检测模式 （1）SYBR Green I 染料 （2）水解探针（Taqman） （3）杂交探针（Hybridization Probes） （4）分子信标（molecular beacon) 发夹引物（sunrise primer) 蝎状引物（scorpion primer) 复合探针（complex probes) 探针的5端标记一个荧光基团，3标记另一个荧光基团。5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团（FRET），正常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光信号。 Taqman探针原理 Taqman探针原理 定量PCR在乙肝检测中意义 1. 判断疾病的严重程度和传染性 2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价 3. 观察抗病毒药物疗效，指导药物用量 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断 5. 预测病情、判断预后 6. 器官移植、母婴垂直传播 标本留取及检测步骤 标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本避免溶血和脂血。 检测步骤：1.反应液配制 2.核酸提取 3.核酸扩增 结果分析：采用样点拟合法，由标准曲线得到病毒的拷贝或IU/ML。 注意事项 1.分区操作：PCR具有超敏感性，因此在检测过程中应分区操作，即分为试剂准备区，样品处理区，PCR扩增区。 2.试验前实验室应使用紫外消毒至少30分钟。 3.操作时戴一次性手套，加样头要求及时更换，吸液时避免飞溅。 注意事项 4.每天实验前，在废物缸内套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸钠液，实验时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。 5.所有试剂试验前充分融化，避免反复冻融。 6.每次PCR反应均应设立阴阳性对照。 流式基本应用 流式细胞术的概念 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 散射光信号 外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后） 荧光信号 使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量 数据分析 数据显示: 直方图 ( Histogram ) 二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density) 三维图（3D Plot） 流式的临床应用 淋巴细胞亚群分析 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞