产品微生物检测方法产品微生物检测方法.doc

产品微生物检测方法 B1产品采集与样品处理 于同一批号的三个运输包装中至少抽取12个最小销售包装样品，1/4样品用于留样，另1/2样品（可就地封存）必要时用于复检。抽样的最小销售包装不应有破裂，检验前不得启开。 在100级净化条件下用无菌方法打开检测的至少3个包装，从每个包装中取样，准确称取10g±1g样品，剪碎后加入到200ml灭菌生理盐水中，充分混匀，得到生理盐水样液。液体产品用原液直接做样液。 如被检样品含有大量吸水树脂材料而导致不能吸出足够样液时，稀释液量可按每次50ml递增，直到能吸出足够测试用样液。在计算细菌菌落总数与真菌菌落总数时应调整稀释度。 B2细菌菌落总数与初始污染菌检测方法 本方法适用于产品除始污染菌与细菌菌落总数（以下统称为细菌菌落总数）检测。 B2.1操作步骤 待上述生理盐水样液自然沉降后取上小清液作菌落计数。共接种5个平皿，每个平皿中加入1mL样液，然后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培养基15-20ml倒入每个平皿内混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±2℃培养46h后，计算平板上的菌落数。 B2.2结果报告 菌落呈片状生长的平板不宜采用；计数符合要求的平板上的菌落，按式（B1）计算结果： X1=A？K＼5……………….B1 式中：X1─细菌菌落总数，cfu／g或cfu／ml； A─5块营养营养琼脂培养基平板上的细菌菌落总数； K─稀释度。 当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字。 如果样品菌落总数超过本标准的规定，按B2.3进行复检和结果报告。 B2.3 复检方法 将留存的复检样品依前法复测2次，2次结果平均值都达到本标准的规定，则判定被检样品合格；其中有任何1次结果平均超过本标准规定，则判定被检样品不合格。 B3 大肠菌群检测方法 B3.1 操作步骤 取样液5ml接种50mL乳糖胆盐发酵管，置35℃±2℃培养24h，如不产酸也不产气，则报告为大肠菌群阴性。 如产酸产气，则划线接种伊红蓝琼脂平板，置35℃±2℃培养18-24h，观察平板上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落。 取疑似大肠菌落1-2个革兰氏染色镜检，同时接种乳糖发酵管，置35℃±2℃培养24h，观察产气情况。 B3.2 结果报告 凡乳糖胆盐发酵管产酸产气，乳糖发酵管产酸产气，在伊红美蓝平板上有典型大肠菌落，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，可报告被检样品检出大肠杆菌。 B4 绿脓杆菌检测方法 B4.1操作步骤 取样液5ml，加入到50mlSCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养18 ～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面呈现一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄菌膜处取培养物，划线接种十六烷三甲基溴化琼脂平板，置35℃±2℃培养18-24h，观察菌落特征。绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不长。 取可疑菌落涂片作革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性菌者应进行下列试验： 氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，30s内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性，不变色者为阴性。 绿脓菌素试验：取2-3个可疑菌落，分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面，35℃±2℃培养24h，加入氯甲烷3-5ml，充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解，待三氯甲烷呈蓝色时，用吸管到移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL，振荡后静置片刻。如上层出现粉红色或紫红色即为阳性，表示有绿脓菌素存在。 硝酸盐还原产气试验：挑取被检菌纯培养物接种在硝酸盐胨水培养基中，置35℃±2℃培养24h，培养基小倒管中有气者即为阳性。 明胶液化试验：取可疑菌落纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置35℃±2℃培养24h，取出放于4-10℃，如仍呈液态为阳性，凝固者为阴性。 42℃生长试验：挑取可疑培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置42℃培养24-48h，有绿脓杆菌生长为阳性。 B4.2 结果报告 被检样品经增菌分离培养后，证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓杆菌试验均为阳性者，即可报告被检样品检出绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌。 B5 金黄色葡萄球菌检测方法 B5.1 操作步骤 取样液5ml，加入到50mlSCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养24h。 自上述增菌液中取1-2接种环，划线接种在血琼脂培养基上，置35℃