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本科毕业论文 重组表达质粒pP9K-mSBD-1的构建 onstruction of pPIC9K-mSBD-1 学 院：兽医学院 专 业：动植物检疫 姓 名：郑佳琪 学 号：090115052 指导教师：曹贵方 职 称：教授 论文提交日期：二Ο一三年六月 摘 要 研究发现，β-防御素主要由哺乳动物的皮肤、黏膜等上皮细胞产生，由 38～42 β-折叠片层结构，由 6 个保守的半胱氨酸残基形成 3 个二硫键稳定结构，由 Cysl-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6PCR 技术，扩增绵羊 β-防御素 1 成熟肽（mSBD-1）基因。扩增出的mSBD-1 因与 T 载体成功连接后，将其亚克隆到毕赤酵母表达载pPIC9K 上，构建真核表达质粒 pPIC9K-mSBD-1。 关键词：防御素 毕赤酵母 pPIC9K质粒 The re-construction of pPIC9K-mSBD-1 Abstract It’s found that β-defensins is mainly composed of mammalian skin and mucous membrane epithelial cells, composed of 38 ~ 42 amino acids. Because of their broad-spectrum of antin icrobial activity and defense against positive and negative Grams bacteria, epiphyte, protozoan and enveloped virus, in additional β-defensins have distinctive antibacterial mechanism, and hardly no-endurance to drug, so the research on β-defensins has become a hot spot in the world. This experimen bases on the laboratory plasmid PUC57-mSBD-1-T which has been built, using the PCR technology to amplificate sheep mSBD-1 gene. With the amplificated mSBD-1 and T carrier successfully connected, put the clone to carry on pPIC9K pichia expression. So eukaryotic expression plasmid pPIC9K-mSBD-1 is built. Key Words: defensins Pichia.pastoris plasmid pPIC9K 目 录 1引言 1 1.1 动物防御素的概述 1 1.2 β-防御素 1 1.3 防御素的应用前景 2 1.4 毕赤酵母表达的优点 2 1.5 选取质粒 pPIC9K 的优点 3 1.6 研究内容 3 1.7 存在的问题 3 2材料与方法 4 2.1材料 4 2.2方法 4 2.2.1 绵羊β-防御素1成熟肽（mSBD-1）基因的克隆 4 2.2.2 pPIC9K-mSBD-1成熟肽重组质粒的构建 7 3 结果 9 3.1 mSBD-1基因的克隆与测序 9 3.2 pPIC9K-mSBD-1 成熟肽重组质粒的构建 10 3.2.1 目的片段与表达载体的双酶切结果 10 3.2.2 菌落 PCR 筛选阳性克隆结果 11 3.2.3 pPIC9K-mSBD-1测序结果 11 4 讨论 12 5 结语 12 致 谢 13 参 考 文 献 14 11.1 动物防御素的概述 200 种以上的多肽。抗菌肽100 个氨基酸残基的多肽，它主要两大家族组成，防御素（defensins）和 cathelicidins，它们广泛存在于哺乳动物的潘氏细胞和巨噬细胞内。20 世纪 80 年代中期, Ganz 研究组在研究吞噬细胞非依赖氧杀菌机制过程中，兔和人中性粒细胞胞浆颗粒中发现一系列一级结构相似的小分子阳离子肽, 由于其广谱的抗微生物活性而首次以防御素一词作为这类肽的命名[1,2]。动物防御素是富含精氨酸残基的阳离子多肽, 成熟分子量3.5～6 kDa有个保守的半胱氨酸残基[3]β-折叠二硫键于防御素稳定的结构，且是抗微生物活性细胞毒效应的要结构基础[]。依其