DNA提取与鉴定2‘例析.ppt

1．实验器材 电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像系统 2．试剂 (1) 0.5×TBE缓冲液(pH 8.3)：5.4g Tris碱，2.75g硼酸，2mL 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，加水至1L。 (2) 溴化乙锭(EB)(10mg/mL)。 (3) 0.7％琼脂糖凝胶：琼脂糖0.7g加至100mL 0.5×TBE缓冲液，加热熔解备用。 (4) 6×凝胶上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，30％甘油溶于水中，于4℃保存。 (5) DNA分子量标准Marker。 【实验材料】 常用的电泳缓冲液  缓冲液 使用液 浓贮存液（每升） Tris-乙酸（TAE） 1×：0.04mol/L Tris-乙酸 50×：242g Tris碱 　 0.001mol/L EDTA 57.1ml冰乙酸 　 　 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸（TPE） 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 10×:10g Tris碱 　 0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸（1.679g/ml） 　 　 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸（TBE）a 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 5×：54g Tris碱 　 0.001mol/L EDTA 27.5g硼酸 　 　 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 碱性缓冲液b 1×:50mmol/L NaOH 1×:5ml 10mol/L NaOH 　 1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸c 1×:25mmol/L Tris 5×:15.1g Tris 　 250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸（电泳级）（pH8.3） 　 0.1% SDS 50ml 10% SDS(电泳级)  凝胶加样缓冲液 缓冲液类型 6×缓冲液 贮存温度 I 0.25%(ol/V)溴酚蓝 4℃ 0.25%(m/v)二甲苯青FF 40%(m/v)蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%(m/v)澳酚蓝 室温 0.25%(m/v)二甲苯青FF 15%(m/v)聚糖体(Ficoll)(400型，Pharmacia)水溶液 Ⅲ 0.25%(m/v)溴酚蓝 4℃ 0.25%(m/v)二甲苯青FF 30%甘油水溶液 Ⅳ 0.25%(m/v)溴酚蓝 4℃ 40%(m/v)蔗糖水溶液 使用凝胶上样缓冲液的目的 增大样品密度； 以确保DNA均匀进入样品孔内； 使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。 1．琼脂糖凝胶板的制备：将0.8％琼脂糖凝胶加热熔化均匀，冷却到60～70℃加EB至终浓度0.5μg/mL，倒入封好的凝胶槽，厚度约3～5mm，在距底板0.5～1mm的位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放人水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶1～2mm为止。 【实验步骤】 【实验步骤】 2．加样：样品中加1/5体积的6×凝胶上样缓冲液，混匀，取10～15μl加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的DNA分子量标准物。 Marker 样品DNA1 样品DNA2 加样量ul 5 5 5 6×Loading Buffer 0 2 2 3．电泳：电压2～10 V/cm胶，待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时，关闭电源。 4．观测：取出凝胶块，置凝胶成像分析仪上观察，即可见橘红色的DNA区带。 【实验步骤】 溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关; 以0.5×TBE作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同; 在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。 　　　　 5.结果:不同方法提取的基因组DNA电泳图谱 12000bp DNA Marker λDNA/HindⅢ λDNA/EcoRⅠ λ/HindⅢ+EcoRⅠ pBR322/HaeⅢ 23130 21226 21227 587 123 9416 7421 5148 405 104 6557 5804 4973 504 89 4361 5643 4268 458 80 2322 4843 3530 434 64 202