染色质纤维的制备案例.ppt

实验十染色质纤维的制备 一、实验目的 1、了解染色质的组装，学会染色质纤维的制备。 二、实验原理 染色质纤维(chromatin fiber)，电镜下所见到的染色质的基本结构单位，粗约30 nm，是由线状DNA双螺旋和组蛋白、非组蛋白、少量RNA以及同DNA、RNA合成有关的酶构成的复合物。 目前，染色质纤维制备技术主要有： 1) 分子梳理 就是利用分子自组装方法硅化载玻片，使其对DNA分子末端具有高度的不可逆的结合能力，然后将DNA溶液加到硅化载玻片上，用另一未处理的盖玻片平放其上，使液滴自然扩散成为厚度约为20微米的薄层，在空气中自然干燥，随着空气—水的相互作用，液滴逐渐缩小，DNA分子被拉直。 2) 动力分子梳理 使用的是动力分子梳理仪，将硅化的载玻片浸入制备好的DNA溶液中温育0.4-5分钟，然后以300 μm/s的恒定速度从DNA溶液中抽出载玻片，锚定的DNA分子自由端随载玻片的移动而被拉直。 3) 低熔点琼脂糖包埋技术利用的是低熔点琼脂糖包埋细胞，经蛋白酶K和RNase消化，使琼脂糖小块中仅含有高分子量的DNA，然后将小块琼脂糖置于载玻片上，在微波炉中熔化，再用干净的盖玻片将DNA溶液从载玻片的一侧推向另一侧。 4) 碱裂解直接涂片法 在人和动物中是直接将培养的细胞经过低渗，固定，加到载玻片的一侧；而在植物中，由于植物细胞有细胞壁，难以直接裂解。因此，在植物中是先提取细胞核，然后将细胞核溶液涂于载玻片上，然后加上碱性裂解液处理，如SDS，使细胞核迅速破裂，DNA分子从核中释放出来，一种方法是倾斜载玻片，借助于重力和溶液的张力使DNA自然伸展开来，另一种方法是用盖玻片将载玻片一侧的DNA溶液均匀地，缓慢地拉至另一侧。两种方法均可以使线状DNA纤维伸展开来。 在DNA作图方面，主要有如下主要优点：①它的分辨率大大提高，分辨率为1-2 kb，灵敏度可达200 bp，与常规分子生物学的限制性酶切图谱相差无几 ，能满足图位克隆的要求。②材料要求不高。③在10 ～ 1000 kb以上的线性DNA分子可被伸展为约2.3 kb/μm，因而可把长度结果(μm级)直接转换为DNA片段大小(kb)，大大加速了物理图谱的构建进程。 三、仪器与材料 1、材料：小麦的黄化苗。 2、用具及药品：载玻片、盖玻片、离心机， Solution 1（DTT，triton X-100，MgSO4） STE缓冲液（SDS，EDTA，Tris-cl）。 四、实验程序 1、取80mg黄化幼叶，稍微剪碎。 2、将叶片放到皿中，加1ml Solution Ⅰ，用手术刀将叶片切碎至匀浆状（3min内完成）。 3、用滤膜过滤。 4、得到的悬浮液用13200rpm离心40s，去上清，印管底部有个小黑点。 5、加30μl Solution Ⅰ重悬、取5μl在干净的载玻片上划线。 6、晾3 min，使其半干，期间将STE用手捂热。 7、取40μl STE覆盖在划线上面，室温下裂解5min。 8、用盖玻片，沿玻片将裂解液下拉，室温干燥。 [作业] ： 1、制备染色质纤维的方法有哪几种，植物中常用的是哪一种？ * *