核酸分子杂交案例.ppt

姜雨航 王雪忆 核酸分子杂交技术原理 及在环境领域的应用 PRESENTERS NAME 摘要 简要介绍在环境微生物研究中几种常见的核酸分子杂交技术的原理 以及其在环境微生物监测、环境微生物分类和环境微生物治理污染中的应用及案例 核酸分子杂交技术在研究环境微生物中发挥重要作用，大大扩展了环境微生物学的研究空间。 引言 核酸分子杂交是一种基于DNA分子碱基互补配对原则用特异性cDNA探针与待测DNA或RNA形成杂交分子的生物学技术 核酸分子杂交具有高度特异性及检测方法的灵敏性 核酸分子杂交技术一般可分为窄缝杂交法（较少使用）、印迹转移杂交法及原位杂交法 CONTENTS 荧光原位杂交(FISH)技术 数量印迹杂交技术 印迹转移杂交技术 基因芯片技术 原理及方法 利用一小段用荧光物质标记过的寡核苷酸序列(一般15～30个碱基)为探针，将其投加到环境样品中，利用与样品中同源性微生物靶DNA互补配对特性 经变性退火复性形成探针与靶DNA的杂交体，在荧光显微镜下直接观察和检测特定微生物的数量与分布。 荧光原位杂交(FISH)技术 荧光原位杂交(FISH)技术 案例 FISH技术的应用克服了除磷细菌和某些硝化细菌难以用常规方法培养等困难。应用ALFIb、HGC和Bet42a探针检测出的细菌量所占比例在10％～64％；应用MP2和CF探针 探测到的细菌含量在4％以下。 在除磷细菌 硝化细菌研 究中的应用 案例 应用FISH技术在EBFR（强化除磷 ）工艺中探测到生物除磷的优势种群Rholocyclus。Wagner和Bruce E R等研究了一套较完善的对硝化细菌检测的FISH技术。FISH技术也被广泛地应用于活性污泥系统、膜生物反应器和硝化流化床反应器等污水处理系统中。 在环境微生物功能研究中的应用 FISH应用在对特定功能菌的发现和分布研究上，用某一类功能酶的保守序列作探针，则对环境中的功能微 生物菌群进行监测。 用纤维素酶的保守序列作探针，就可以研究环境中具有纤维素降解能力的微生物的分布。Bet he H等用NS0190或NS01225作探针，可检测出环境中的氨氧化细菌的存在。 荧光原位杂交(FISH)技术 数量印迹杂交技术 由其信号的比值来反映某类特定微生物菌群的相对丰度，还可间接反映该类微生物的相对生理活性。 应用数量印迹杂交，可获得环境样品中特定DNA序列的丰度信息。利用通用型探针和专一性探针与环境样品中的总DNA和特定类群DNA进行杂交 Monique等利用MPH一730(通用型探针)和MPHm一994(专一性探针)两种探针以测定噬甲基菌属(Methylophaga)和海洋中的噬甲基菌属的相对丰度，结果发现噬甲基菌属在海洋沉积物中广泛存在 从环境样品中提取细菌总DNA，用限制性核酸内切酶切割、电泳，将条带转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上与DNA或RNA探针杂交，从杂交条带的数量推知功能微生物菌群的丰度 印迹转移杂交包括Southern和Northern印迹杂交技术，应用于样品中的DNA和RNA样品，以前者在环境微生物研究中应用较广 印迹转移杂交技术 Southern印迹杂交技术原理 从环境样品中提取细菌总DNA，用限制性核酸内切酶切割、电泳，将条带转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上与DNA或RNA探针杂交，从杂交条带的数量推知功能微生物菌群的丰度 印迹转移杂交包括Southern和Northern印迹杂交技术，应用于样品中的DNA和RNA样品，以前者在环境微生物研究中应用较广 印迹转移杂交技术 Southern印迹杂交技术原理 Northern技术是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小 将耐药基因导入小鼠骨髓细胞 ,能使之获得对化疗药物的抵抗 ,骨髓造血和免疫功能得到一定程度的保护。利用含双顺反子的逆转录病毒载体将醛脱氢酶基因和多药耐药基因导入细胞 ,并在体外获得有效表达。 印迹转移杂交技术 Northern印迹杂交技术原理 应用 基因芯片是将大量核苷酸探针以点阵列方式高密度地排列于特定的支持物上．如硅片、玻片、薄膜等，与样品DNA杂交后通过激光共聚焦等技术分析靶DNA的存在和相对含量的现代分子生物学方法 将某一分类单元的特异DNA片段或功能基因的保守片段作为探针整合在芯片上，则可以对环境样品中的微生物结构与功能进行监测分析，如16sRNA基因芯片。 基因芯片技术 方法 原理 基因芯片技术 应用一 应用二 应用三 生化循环过程关键酶(如去硝化)的功能基芯片，可用于检测自然环境中微生物