RIP实验技术范本.doc

RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同（如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等）。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。 Millipore基于磁珠的RIP实验流程 RIP 实验基本原理： 1. 用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。 2. 防止非特异性的RNA的结合。 3. 免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。 4.结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。 延伸阅读：95%的人类基因组并不编码基因，而是产生大量的非编码RNA,真正编码蛋白质的基因只占人类总基因组的约2%。这些非编码RNA在生命的生长发育的各个阶段都发挥着重要的调节作用，与艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多种病变密切相关，并且参与着干细胞和表观遗传学调控。而RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控，包括剪接（splicing）、出核转运（nuclear export）、mRNA 稳定性以及蛋白转译过程，因此，对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化。因此，RNA研究也被越来越多的科学家重视起来，目前已经成为生命科学研究中一个炙手可热的领域，而RIP技术也逐渐成为RNA研究领域的一项常规方法，帮助我们了解越来越受关注的转录后调控网络。 RT-qPCR原理 标签：?PCR?RT-qPCR 相关专题：QPCR 广州赛诚生物基因表达调控专题Qiagen：10个窍门助你更好掌控qPCR实验沐赛生物:快速建立基因敲除细胞系 实时RT-PCR定量测定mRNA实时RT-PCR应用于明确要求定量数据分析的分子医学、生物工程、微生物学和诊断学定量测定mRNA所用的的方法。尽管他被描述成“黄金”标准，但他还远远未达到成为标准检测的程度。由RNA模板的多变性、含量测定的设计和方案造成的很重要的问题，与不恰当的数据标准化和数据分析一样，也是被众人所知却又忽视掉了。标准化的第一步，我们描绘了一系列RT-qPCR草案的基本的技术步骤，要求产生的数据具有可靠性和重演性。我们更愿意强调说，无论如何，RT-qPCR数据只是关于一个细胞或组织给定转录物的量的快速测定的信息。任何可变的mRNA水平的生物结果分析必须包括关于调节RNA、蛋白含量和蛋白活性的附注信息。这里描述的整个试验，包含了最初的含量设计到qPCR数据分析，需要大约15小时。 INTRODUCTION RT-QPCR包括三部分：①依靠逆转录酶将RNA转变成cDNA; ②用pcr扩增cDNA; ③实时监测和定量测定cDNA的量 尽管已经选用为定量测定RNA的方法，这种含量测定的安全性依然值得商榷。首要的是以下几点：①结果依赖于模板的量、质量和最佳的方案设计;②逆转录反应不是标准化的，因此，可能多变性高;③数据分析高度主观化，如果操作不恰当含量测定的结果就会混乱。因此，通过质量评估每一个RT-qPCR组分含量和保持数据分析的统一性来降低多变性和扩大重现性是必要的。基因表达测定标准化明确要求，与人类临床诊断分析有显而易见的关系。因此，我们关注这个实验的遍及整个实验指导的质量控制。 THE ASSAY RT-PCR?(qPCR)在单管PCR的扩增和测定步骤结合使用荧光指示染料。含量的测定依赖于测定增加的荧光信号，其强度与每一次PCR循环的产物量成正比。此外，在单次反应中，用不同染料标记的探针能够监测和定量多标记的目的基因。在一次循环中，单次PCR荧光第一次超过既定的或背景荧光阈值，这个参数就称为循环阈值(Ct)或交叉点(Cp).起始浓度越高，Ct值越小。当维持PCR分析滴定终点敏感性和特异性时，这种荧光和扩增物的相关性使目的基因能够在一个较大的范围内被精确定量。闭管(均质)形式消除了扩增后手工操作的需要，显著的减少了手工操作的时间和污染的风险。 Current problems 这种技术的广泛应用造成大量的可定量测定数据的方法的产生，利用①新鲜的