植物染色体原位杂交案例.ppt

原位杂交[In situ hybridization，简称ISH]，也称作杂交组织化学或细胞学的杂交，是一种能够从形态学上证明特异性的DNA或RNA序列存在于个别细胞、组织部分，单细胞或染色体中的技术，是分子生物学和组织化学、细胞学结合的产物。 原位杂交技术是从Southern和Northern杂交技术衍生而来，包括染色体原位杂交和RNA原位杂交，其基本原理是：含有互补顺序的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内的DNA或RNA形成稳定的杂交体。 原位杂交技术主要方法 一、荧光原位杂交 二、基因组原位杂交 三、原位PCR 四、引物原位杂交技术 五、原位杂交结合显带标记技术 六、原位杂交结合免疫组织化学的双标记技术 七、电镜原位杂交技术 八、整体荧光原位杂交技术 九、DNA纤维荧光原位杂交 fiber-FISH 一、荧光原位杂交 (Fluorescence in situ Hybridization) 是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名，基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。 DNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平的分析。 二、基因组原位杂交 (Genome in situ Hybridization) 基因组原位杂交是在分子水平上检测外源染色质的一种有效方法,其探针是总基因组DNA.该技术广泛应用于植物进化和亲缘关系的鉴定上。 三、原位PCR 原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。 原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。 扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。 四、引物原位杂交技术 是通过退火一个寡核苷酸DNA 引物到制备在载玻片上的染色体的变性 DNA 上 ,用渗入 的标记核苷酸在原位进行酶促延长并进行检测的染色体标记技术 rDNA应用 片断扩增应用 Fiber-FISH 在FISH分辨率的决定因素中，最重要的是所用的靶DNA分子在其载体上的浓缩度，也就是DNA分子的三维空间包裹程度。由Heng、Wiegant等首创的DNA纤维上的FISH，将分辨水平提高到与常规分子生物学技术Southern Blot分析相当的水平。1996年Fransz等人将这一技术引入植物拟南芥和番茄的小重复序列和cosmid连接群研究，之后由钟筱波等人在水稻、玉米、小麦和油菜等多种植物中成功应用。 THANK YOU VERY MUCH 白菜 A为杂交前核型； B为同一核型杂交后结果 芋头间期核 A为杂交前间期核；B为杂交后结果 荔枝 菜花 西葫芦 黄瓜（津春四号） 黄瓜（津优一号） 黄瓜（津优一号）间期核 黄瓜（津优一号）间期核 GISH的应用 染色体配对分析及基因组类型的确立 GISH与异源多倍体的起源以及基因组间关系的研究 异缘姐妹种（sibling species）的基因组分化的研究 黑麦A、B染色体着丝粒区DNA同源性的荧光原位杂交分析 黑麦A、B染色体端粒区同源性的 荧光原位杂交分析 B染色体微切割片段在玉米中期和间期细胞(2n=20+4B)中的原位杂交定位 小偃麦代换－易位系的GISH核型。St组DNA作探针、小麦总DNA作封阻,表明其染色体组成为2n=42=38w+1E+1E/W(端部)+2W/St(端部) 八倍体小偃麦TAI7045的GISH分析。用St基因组DNA作探针、小麦总DNA作封阻表明其染色体组成为2n = 56 = 42 wheat + 6 St + 2 St-sat + 4 Es + 2 Es/St * 植物染色体原位杂交技术 染色体原位杂交技术是根据核酸分子碱基互补配对的原则(A—T，G—C)，将有放射性和非放射性标记的探针与染色体上经过变性后的单链