Realtime PCR的原理和应用PPT.ppt

Realtime PCR的原理和应用 Yang Sun, PhD Product Specialist 主要内容 Realtime PCR的原理 Realtime PCR的应用 Realtime PCR的问题及解决方法 Real Time PCR的概念 Real time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0(1+Ex)Ct=M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0(1+Ex)Ct(2) 整理方程式(2)得: log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log M (3) 最后结论： Log X0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 Real Time PCR的方法 染料法 使用内掺式染料 SYBR Green I 探针法 使用序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) Real Time PCR的方法 SYBR GREEN法 Real time PCR数据处理方法 PCR效率的计算方法 Real time PCR数据处理方法 Real time PCR数据处理方法 Cited from Clinical Chemistry 48:81178–1185 (2002) Real time PCR数据处理方法 主要内容 Realtime PCR的原理 Realtime PCR的应用 Realtime PCR的问题及解决方法 Realtime PCR的应用 定量起始模板浓度 基因型分析 产物鉴定 SNP分析 病原菌检测 药厂GMP认证 突变测定 物种鉴定 主要内容 Realtime PCR的原理 Realtime PCR的应用 Realtime PCR的问题及解决方法 Real time PCR的问题及解决方案 该选择绝对定量还是相对定量？ 绝对定量的问题： 费时费力，而且也有相当多的问题，目前广泛使用的在260nm波长下定量的方法与众多因素有关，如水、缓冲液、仪器性能，乃至于核酸的抽提过程都会影响到结果的稳定性。 标准品的稳定保存很难获得成功，高浓度的核酸物质易于被降解，而每次配制新的标准品又会增加批间差异。 每次测定样本都要同时测定标准品，而热循环仪的样本孔往往有限，所以使得不能在单批内测定更多的样本，这样也就使实时PCR的高通量有所降低。 由于样本来源存在极大的差异，所以很难保证标准品与目的基因的扩增效率一致。这样会大大增加结果的变异，即使是各样本的DNA（或cDNA）有极小的差异或模板片断不均一，都会对定量的结果造成很大的差异。 若选择绝对定量则应该注意： 选择与样品具有完全相同序列的标准品 每次进行实验时尽量使用新鲜配制的标准品 尽量选用完全相同的体系 若选择相对定量则应该注意： 选择合适的看家基因，通常可供选择的看家基因包括GAPDH 、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA 尽可能测定扩增效率 Realtime PCR引物设计原则 引物应该非常特异 Tm在58－65℃之间 GC含量在30－80％ 不要有连续的相同的碱基，尤其是G如果有超过4个连续的G则此引物不可用 3’末端最后5个碱基中不能含有超过两个的G或C 两条引物的退火温度应该尽量接近 避免引物二聚体以及发夹结构 产物在100－150bp之间最大不能超过200－250bp 若测定cDNA的含量时设计的探针最好时跨内含子的 应该选择至少时经过PAGE纯化的引物 Realtime PCR探针设计原则 Tm比引物高8~10度 G不能在5‘端 碱基C的数量要大于G的数量 G连续必须小于4个 GC含量20~80% 探针长度9到40个碱基 探针不能自身形成发夹结构或者不能和引物形成二聚体 Real time PCR的问题及解决方案 杂交探针需要注意什么？ 在使用杂交探针进行实验时，必须注意防止探针－引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸。引物－探针二聚体的形成，主要是因为探针可与引物的3’末端杂交，其形成以后，会致使此二聚体扩增，从而同目的基因竞争反应的原料，致反应的效率下降。探针其本身能同目的基因相结合，且其解链温度高于引物，所以它可能作为引物而引发延伸反应