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RNA干扰（RNAi） 1804组 张 慧 导 师 梁鑫淼研究员 2006年4月12日 主要内容 RNAi简介 RNAi的作用机制 RNAi的产生 RNAi的应用 小结 什么是RNAi？ RNAi（RNA interference）是指在生物体细胞内，dsRNA引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。 一种转录后水平的基因沉默 生物体内普遍存在 抵御外在感染的重要保护机制 RNAi的发展历程大事记 1995，RNAi现象首次在线虫中发现。Cell，1995 ，81：611-620 1998，RNAi概念的首次提出。Nature, 1998, 391（6669）：806 1999，RNAi作用机制模型的提出。Cell，2000，101（1）：25-33 在线虫、果蝇、拟南芥及斑马鱼等多种生物内发现 RNAi现象。 2001，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉 默现象。Nature，2001，411（6836）：494－498 RNAi技术被《Science》评为2001年度的十 大科技进展之一。 2002至今，有关RNAi的研究蓬勃开展，是分子生物学领域最为热门的方向之一。 RNAi的分子生物学特性 RNAi是siRNA介导的转录后水平的基因沉默 RNAi作用针对的是靶基因的外显子序列 高特异性，只针对同源靶向mRNA 高效性，极低浓度的siRNA就能完全抑制基因表达 RNAi作用具有可传递性 RNAi的研究方法 siRNA的制备方法 体外制备 ---化学合成siRNA ---体外转录合成siRNA ---用RNaseⅢ 消化长片段dsRNA得到siRNA 体内表达 ---利用质粒或病毒载体表达siRNA --- PCR方法制备siRNA的表达框架 siRNA制备方法比较 应用 基因功能研究 基因治疗 ---基因缺陷 ---病毒感染 ---肿瘤疾病 其它应用 ---植物代谢 ---细胞信号传导通路 基因治疗 肿瘤细胞的MDR1基因编码的p-gp糖蛋白过度表达，引起肿瘤的MDR Hait等针对MDR乳腺癌细胞的MDR1基因，使用化学合成的siRNA进行干扰 结果表明：MDR1的mRNA和p-gp水平显著下降，细胞内紫杉醇和阿霉素积累增多，而且紫杉醇和阿霉素对乳腺癌细胞的细胞毒性大为增强。 基因治疗 植物代谢 2003年，Ogita等首次报道RNAi技术在咖啡中的成功应用。 选取咖啡因生物合成途径中的关键酶之一可可碱合酶，将siRNA转入植株内，从而抑制咖啡因的合成，转基因咖啡植株的咖啡因产量比正常植株低70％，可以用于生产低咖啡因含量的咖啡豆。 是RNAi技术在药用植物代谢工程领域的经典范例。 药用植物代谢 2004年，RNAi在罂粟中成功应用。 可待因酮与吗啡具有共同的前体分子－(S)-网状番茄枝碱。 采用RNAi技术抑制可待因酮还原酶基因家族中所有基因的表达，使(S)-网状番茄枝碱和甲基- (S)-网状番茄枝碱积聚，从而提高罂粟中吗啡的含量。 为增加植物中高药用价值的生物碱产量提供了成功的案例。 小结 存在的问题 RNAi作用太过精确 RNAi产生原因未知，作用机制不确知 如何使外源RNA进入哺乳动物体内 如何将RNAi技术运用到临床试验 小结 前景与展望 RNAi是调控基因表达开关的“士兵” 可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具。 在未来的基因治疗中发挥作用 对整个生物理论产生巨大而深远的影响 谨慎利用 参考文献 Cell，1995 ，81：611-620 Nature, 1998, 391（6669）：806 Cell，2000，101（1）：25-33 Nature，2001，411（6836）：494-498 Science, 2002，296(17)：1263-1265 Nature，2002，418（6894）：244-251 Nature，2004，430（6894）：161-164 RNA，2002，8（11）：1454-1460 Nature，2003，423（6942）：823 Nat Biotechnol，2004，22（12）：1559-1566 * * Seminar I 预备知识 dsRNA：双链RNA，包含正义链和反义链 Dicer：属于RNaseⅢ 家族，是dsRNA的特异性核酸内切酶 siRNA：small inter