生物化学技术原理及应用..doc

生物化学技术原理及应用 题型： 1.填 空 题：（0.5分／空，共20分） 2.名词解释：（2分／个，共10分） 3.判 断 题：（1分／题，共20分） 4.简 答 题：（10分／题，共50分） 第一章生物大分子物质的制备 一.相关概念： 1.抽提：用抽提液（常用缓冲液，稀酸，稀碱，有机溶剂例如丙酮，乙醇）进行反复萃取，将原料中有效成分最大限度分离出来的过程。 二.知识点： 1.理想抽提液具备：有效成分溶解度大，杂质不溶解或溶解度很小，来源广泛，价格低廉，操作安全。 2.影响有效成分抽提的因素：溶液PH（偏离等电点的稳定范围内）,离子强度（极性大在离子强度高，极性小在离子强度低），温度（低温0摄氏度时最稳定），搅拌（促使抽提物抽提液相互接触，增加溶解度，采用温和适中的速度，速度慢起不到搅拌作用，速度快产生气泡，使酶变性失活）氧化（氧化剂氧化分子与巯基导致失活，加入还原剂防止氧化），水解酶（蛋白受本身固有水解酶影响，加入抑制剂后使水解酶丧失活性），金属离子（蛋白与金属离子结合生成沉淀复合物，用无离子水或重蒸水配制试剂，配制试剂中加1～3mmol／L EDTA），抽提液与抽提物比例(5:1,抽提液过多有利于有效成分提取，不利于纯化程序。否则，反之)。 3.浓缩常用方法 沉淀法，吸附法，超过滤法，透析法，离心法，干燥法。 4.影响生物大分子保存的主要因素 空气（隔绝），温度（低温方面），水分，光线，样品的PH，时间。 第二章离心 一.知识点： 1.离心的基本原理：生物样品悬浮液在高速旋转下，在巨大的离心力作用下，离心力大于悬浮力，使悬浮颗粒以一定的速度沉降下来。 2.离心力表示方法：rpf 3.离心机的种类：普通离心机（转速小于1000），高速离心机，超速离心机（转速大于2000）。 4.离心机主要构件：转子，离心管 5.离心基本方法：沉淀离心，差速离心，密度梯度离心 6.离心机操作时注意: (1)转速设定，离心力悬浮力／2。(2)对称于中心的两个离心管重量要平衡。(3)加样量勿超过3/4。(4)对于低温离心机要预先设置低温。(5)离心过程中注意听声音，看仪表。 第三章电泳技术 一.相关概念： 1.电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。 2.电泳迁移率：带电粒子在单位时间内移动的距离叫电泳迁移率。 3.电渗现象：液体层相对于介质移动的现象。 4.两性电解质：所带电荷随着溶液酸碱度的变化而变化，酸性溶液中带正电荷，碱性溶液带负电荷。 5.印迹：将生物大分子凝胶转移到物像载体上。 二知识点： 1.影响电泳分离的主要因素 内因：分子量大小，分子形状，分子性质，带电荷量，分子直径。 外因：电场强度，溶液PH，溶液黏度，离子浓度，缓冲液性质。 2.琼脂糖凝胶聚合原理：依靠琼脂糖上的羟基，在聚合过程中，羟基与羟基上的氢键的聚合。 3.PAGE的组成，聚合原理及聚合方式 ［1］组成：丙烯酰胺（单体）和甲撑双丙烯酰胺（双体交换剂）组成。 ［2］原理：丙烯酰胺（单体）和甲撑双丙烯酰胺（双体交换剂）为材料，在催化剂作用下，聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之间通过甲撑桥连接而形成的三维网状结构物质。 ［3］聚合方式：（1）化学聚合法：加入过硫酸铵，当丙烯酰胺，交联剂，四甲基乙二胺的水溶液中加入过硫酸铵，立即产生自由基，丙烯酰胺与自由基作用，随之活化。 （2）光催化法：B2作为催化剂，光聚合过程在光激发下催化完成，核黄素在氧及紫外线作用下，生成含自由基的产物，与上述AP作用相同。 4.PAGE分离样品时的三种效应：浓缩效应，分离效应，电荷效应。 5.SDS电泳(变性凝胶电泳)主要成分的作用： （1）甘油或蔗糖：密度大，与样品结合，不发生漂样。 （2）SDS:与蛋白质结合，破坏高级结构，破坏氢键，去除蛋白质带电荷差异。 （3）巯基乙醇：破坏二硫键，使完整结构变松散。 （4）溴酚蓝：电泳指示剂。 6.等电聚焦电泳基本原理：小分子进入凝胶内部，流下时路程较长，而大分子物质却被阻排在外部，下来的路程短。 7.等电聚焦电泳的基本原理：蛋白质等电点不同，在同一PH下带电荷量不同从而进行分离。 8.2D－PAGE的操作顺序：先等电聚焦电泳，再SDS. 9.Western blotting的操作步骤：（1）对蛋白质样品电泳分离（2）转膜（3）封闭（4）加入一抗与目的蛋白结合（5）加二抗（6）洗膜（7）膜的光分析。 第四章沉淀法 一相关概念： 1.沉淀：溶液中的物质由液相变成固相析出的过程。 二知识点： 1.制备蛋白质常用的沉淀方法 （1）.盐析法：中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性；加入中性盐后，破坏了水膜暴露出疏水区域；同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体。 （2）有机溶剂沉淀法：破坏蛋白质分子表面