甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因的烟草转化及转基因植株的鉴定..doc

甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因的烟草转化及转基因植株的鉴定 摘要：本已构建的pET(CmPP)质粒为模板，再扩增CmPP，然后通过酶切克隆到质粒pBI121中，构建植物表达载体pBI121(CmPP)，并将其转化到根癌农杆菌LBA4404中。通过农杆菌侵染的叶盘转化法和多重PCR鉴定，获得了阳性CmPP转基因烟草植株。 关键词：甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶农杆菌转基因烟草 Tmembrane-integral pyrophosphatase gene of Clostridium methylpentosum and identification of the transgenic tobacco plants Abstract: In this work, using the constructed plasmid pET(CmPP) as DNA template, the membrane-integral pyrophosphatase gene CmPP of Clostridium methylpentosum was re-amplified, and subcloned into the plasmid pBI121 by enzyme digestion to create the plant expression vector pBI121(CmPP) that was further transformed into the Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404. Through the leaf disc transformation by Agrobacterium infection and multiple PCR identification, the positive transgenic tobacco plants of CmPP gene were obtained. Keywords: Clostridium methylpentosum, membrane-integral pyrophosphatase, Agrobacterium transformation, transgenic tobacco 1 前言 膜焦磷酸酶膜PPase是焦磷酸PPi）储备能量转移和利用的动员蛋白，用以维持阳离子梯度进而帮助细胞在胁迫条件下存活膜PPase根据其转运离子的特异性可分为Na+-PPaseNa+,H+-PPase和H+-PPase三个亚家族，其中以Na+-PPase作为膜PPase膜PPaseK+激活而总体上可划分为K+依赖型和K+非依赖型两大类[13]。具有H+泵活性的膜H+-PPase广泛存在于包括古生菌、真细菌、植物和原生动物在内的生物三界中，发现最早，在构建抗逆生物尤其是植物方面的应用已十分引人瞩目H+-PPase的各种转基因植物在诸多逆境条件（如高盐、干旱、磷或氮营养亏缺等）下表现出增强的抗性或耐受性[14-20]。相比较，其它两个亚家族PPase（Na+-PPase和Na+,H+-PPase）几年前或最近仅在原核生物H+-PPase对现世植物适应逆境的关键作用。它们具有Na+泵活性和直接的排Na+作用以及在创建抗盐转基因生物的巨大应用潜力。但是，关于它们的应用研究目前报道。本工作特地针对人肠道甲基戊糖梭菌的膜整合PPase（CmPP推测是Na+,H+-PPase亚家族成员），其基因2材料与方法 2.1 实验材料 植物实验材料：烟草品种为Nicotiana tabacum Xanthi，种子由本实验室提供，取其一个月大的无菌苗叶片作为转化外植体。 宿主菌及载体：本工作所用大肠杆菌菌株DH5α、植物载体pBI121、根癌农杆菌LBA4404均为本实验室保存。 2.2 主要试剂和耗材 2.2.1 生化和分子生物学试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DreamTaq DNA聚合酶等购于Thermo Scientific Fermentas公司。蛋白胨、酵母提取粉等购于生工生物技术有限公司。氨苄青霉素购自北京鼎国生物技术公司。常用试剂盒如胶纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒，溶液纯化试剂盒植物基因组DNA提取试剂盒由北京天根公司提供。 2.2.2 激素与抗生素 （1）a-萘乙酸(NAA)：用95%的酒精溶解后，加水定容，配制成0.2mg/mL的母液，用0.22μm滤膜过滤灭菌后于4℃保存。 （2）6-苄氨基嘌呤(6-BA)：用2M的氢氧化钠溶解后，加水定容，配制成2mg/mL的母液，用0.22μm滤膜过滤灭菌后保存于4℃。 （3）羧苄青霉素(Car)：储存浓度为250mg/mL，称取2.5g的药品溶解在无菌水中，定容到l0mL后用0.