核酸分离纯化及电泳.doc

基因工程原理 Introduction to genetic engineerins 一、基因工程的定义： 在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。 二、基因工程诞生的理论基础 1 . DNA是遗传物质 1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。 1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。 2. DNA双螺旋结构 1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。 3、中心法则与遗传密码 1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则” 1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码 在遗传学上，把遗传信息的流动方向叫做信息流。信息流的方向可以用科学家克里克提出的“中心法则”来表示。从“中心法则”可以看出，遗传信息的一般流动方向（图中红线所示）是：遗传信息可以从DNA流向DNA，即完成DNA的自我复制过程，也可以从DNA流向RNA，进而流向蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译过程 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 三、基因工程诞生的技术突破 1. 限制性内切酶（restriction enzymes） 1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。 2. DNA连接酶（ligase） 1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。 3. 载体（vector） 1972年前后使用小分子量的细菌质粒和(噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。 4. 感受态体系 1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。 5. 琼脂糖凝胶电泳 1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。 6. DNA测序技术 1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术。 四、基因工程的特征 1. 跨物种性 外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。 2. 无性扩增 外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。 五、基因工程的主要操作内容 1. 目的基因的获取 从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。 2. 重组体的制备 将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。 3.重组体的转化 将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。 4.克隆鉴定 挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。 5.目的基因表达 使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。 第一节 分子生物学实验室常用设备 温度控制系统 冰箱：4 0C、-20 0C、-70 0C 恒温培养箱：隔水式、电热式 鼓风干燥箱 恒温水浴 低温循环水浴 微量加热器 恒温空气摇床 PCR热循环仪 制冰机 冷库 高压蒸汽灭菌器 电泳设备 琼脂糖凝胶电泳系统 垂直板凝胶电泳系统 转移电泳系统 紫外分析仪 凝胶成像系统 离心设备 台式高速冷冻离心机 高速冷冻离心机 大容量离心机 超速离心机 分光光度计 722S、7200可见分光光度计 紫外可见分光光度计 其它 PH计 电子天平 旋涡振荡器 磁力搅拌器 超声波破碎仪 超净工作台 纯水器 第一章 基因工程的主要技术原理 第一节 DNA的提取与纯化 由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。 一、质粒DNA的提取 （一）、质粒载体概念 细菌质粒是独立于宿主基因组复制、编码抗生素抗性基因的小型环状DNA分子、运载克隆DNA的常用载体。 质粒特点： 染色体外的小型环状分子， 大小约为2—200kb， 通常以多拷贝(可多达几百个)形式存在于宿主细胞中。 质粒含有复制起点(ori)用以保证质粒的自主复制 正常复制依赖宿主细胞中的聚合酶及其他成分。 质粒一般仅携有几个基因抗生素物质的抗性基因。 最常见的抗性基因是amp+基因，编码可以降解青霉素类抗生素如氨苄青霉素的β—内酰胺酶。 另一种常见抗性基因是tetA基因