注射用重组人白介素.doc

注射用重组人白介素—4外源DNA残留量的检测 摘要 目的 检测本实验室生产制备的重组人白介素—4原液中外源DNA的残留量 方法 提取大肠杆菌基因组DNA，经过酶切变性处理后，加入地高辛标记探针，再用探针进行杂交实验。 结果 包括DNA纯度及浓度检测、基因组DNA酶切效率的检测、探针标记效率的检测、杂交的免疫检测，显示五个结果均正常。结论 供试品（注射用人重组白介素—4原液）中外源DNA的含量小于0.1ng/μL，本批次产品合格。 关键词 白细胞介素—4 外源DNA残留 DIG探针标记 Detection of exogenous residues DNA from Injective Recombinant Human IL-4 Abstract Objective Detect the exogenous DNA in human recombinant interleukin - 4 concentrate residues which produced by our own lab. Method Extract E. coil’s genome DNA, deal with the enzyme denaturation, add tags digoxin probe, probe hybridization experiments. Test results including five: DNA purity and concentration, genomic DNA enzyme efficiency of detection, probe detection, the efficiency of hybridization of immune detection, experiment shows five results were normal. Conclusion The test shows that the samples (concentrate) employing recombinant interleukin - 4 injection of exogenous DNA content is less than 0.1 ng/mu L, so this batch product is qualified. Keyword Interleukin-4 the exogenous residues DNA DIG labeled probe 前言 基因工程药物中宿主细胞残余DNA对人体可能造成插入突变，导致抑癌基因失活，癌基因被激活等严重危害，外源大肠埃希氏菌DNA进入人体后, 可能导致肿瘤的发生[1]， 因而对基因工程药物中外源 DNA 的控制具有重要意义。注射用重组人白介素—4中外源DNA经变性为单链后，吸附于固相尼龙膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成双链DNA，称为杂交[2]，应用DNA杂交技术，将特异性单链DNA经地高辛（DIG）探针标记后，与吸附在尼龙膜上的注射用重组人白介素—4单链DNA杂交，加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体与地高辛标记的探针相结合，再加入碱性磷酸酶的作用底物CSPD，通过相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测注射用重组人白介素—4中外源DNA残留量[4]。 目前，基因工程药物在攻克肿瘤、心血管系统等一些疑难病症等领域，发挥着巨大的作用[8]。本实验室生产的注射用重组人白介素—4，采用大肠杆菌作为工程菌，提取 pET32a( + )载体与 pUC18/ mIL24 质粒 ,用限制性内切酶NdeI酶切得到带有互补粘性末端的载体和目的基因片段 ,用 T4 DNA 连接酶连接后转入JM109 中 ,涂布在加有氨卞青霉素的固体LB 培养基上 ,培养过夜[11]。挑取阳性菌落，经质粒酶切验证、DNA测序，确认质粒构建正确且无突变后 ,转入大肠杆菌BL21 感受态细胞 ,从而获得 pET32/ rmIL24 质粒的 BL21(DE3)表达工程菌。控制相关条件促使人的白介素-4基因（目的基因）表达，生产重组蛋白药物人白介素—4（约15KD）。经目的基因工程菌的发酵，收集菌体沉淀，超声破菌后离心，3M盐酸胍洗涤，7M盐酸胍溶解，制得包涵体，逐步降低变性剂浓度复性后，再经脱盐、分子筛层析、离子交换层析等系列纯化后[3]，得到产品原液。重组的蛋白产品功能一般与天然相似，但由于生产方法不同，其纯度要求、毒副作用和体内药物代谢动力学性质仍与天然的产品有很大区别[9]，所以对原液进行相关检测是必要的，外源DNA的含量超