培养细胞的观察和检测方法-1.ppt

培养细胞的观察检测方法 生物技术教研室 李延兰 活细胞的观察检测方法 培养细胞常用的染色方法 细胞生长状况有关指标的检测方法 细胞生物活性的有关化学检测方法 电子显微镜技术 一、活细胞的观察检测方法 肉眼观察 相差显微镜观察 肉眼观察 一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。 大多数细胞适于在pH 7.2～7.4条件下生长，低于pH 6.8或高于pH 7.6对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。 随细胞数量的增多、代谢加强，释放CO2增多，使pH 降低。为了维持培养基恒定的pH ，多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。 羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。 若培养瓶、瓶塞漏气， 使CO2溢出，或者由于洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，致使细胞难以生长，甚至死亡。 玻璃器材 常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管。 首次使用： 重复使用的处理步骤： 显微镜观察 相差显微镜 （phase contrast microscope） 活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。 20世纪30年代 荷兰 Zernike 原理：利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构变得清晰。 相差显微镜观察活细胞的步骤如下： 细胞的生长状态 生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。 若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。 BMSCs 各种细胞及各代细胞增殖的时间不尽相同。 原代细胞、成体组织的潜伏期较长，24h后仅见到部分细胞开始贴壁，9～12d长满瓶底，细胞融合呈交叉重叠生长。 传代细胞系、胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期、对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。 一旦发现细胞长满瓶底80％就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。 悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。 Anip973 注意事项 标准化生产的培养板、培养瓶或皿一般成像效果都较好，但反复刷洗过的玻璃或塑料器皿将严重影响分辨力。 准备观察的瓶、皿要平坦，质地均匀，透光度好，在观察前将培养瓶、皿面擦净。 天气较冷时，由于温差使培养瓶内壁形成雾滴而影响观察的清晰度，可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁，以得到好的相差像。 对原代细胞培养进行相差显微照相，应在换液后进行，这样可以去除漂浮的组织块和死细胞，提高成像清晰度。 观察细胞时要有无菌概念，动作要轻，避免猛烈震荡；观察时间不要太长，观察次数也不要太频繁，以免影响细胞生长。 活细胞的观察检测方法 暗视野显微镜技术观察活细胞 缩时显微镜摄影观察 体外活细胞染色观察 暗视野显微镜技术观察活细胞 （dark field microscope) 原理：利用特殊聚光器使光线不能进入物镜，经过标本的散射光线使物镜被放大，因此在黑暗背景中可呈现明亮的像。 优点：反差增大，分辨率提高，可观察到5nm的微小质点。 应用：观察活细胞内的细胞核、线粒体、细菌和霉菌等。 缩时显微摄影术观察 （time-lapse cinemicrophotagraphy，TLCM） 优点：可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。 缺点：较昂贵 体外活细胞染色观察 体外活细胞染色就是在体外培养条件下，用某种染料对活细胞进行染色，而不影响活细胞生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。 中性红染色 常用活体染料，一般浓度为1：10000，用生理盐水（或Hanks液）溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计