基因工程实验课件.ppt

基因工程实验 实验目录 实验一 实验计划表 实验二 染色体DNA的提取 实验三 PCR扩增 实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接 实验五 感受态细胞的制备 实验六 重组质粒的转化 实验七 质粒的提取 实验八 重组质粒的酶切鉴定 实验一 实验计划表 一、实验目的 基因工程（Gene Engineering）又称ＤＮＡ重组技术，把不同生物的ＤＮＡ与载体相连，并导入到受体细胞中去增殖、表达。 基因工程包括切、接、转、增、检五大要素。 凝胶电泳系统、微量移液器、三角瓶、微波炉、铲子、手套 琼脂糖、1×TBE、加样缓冲液 ⑴ 目的基因的获取 　　　基因组总ＤＮＡ提取　　凝胶电泳检测　　 ＰＣＲ扩增目的基因　　 ＰＣＲ产物的电泳检测　　 ＰＣＲ产物纯化　　　获得目的基因ＭＨＣ ⑵ＤＮＡ重组、转化 　　　ＭＨＣ与pMD18-T连接　　DH5a感受态细胞制备　 　 转化、平板涂布、培养 ⑶筛选与鉴定 　　　抗生素抗性筛选　　挑单菌落培养　　提取质粒　　质粒酶切、电泳检测　　 2.微量移液器的使用 将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。 等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、 提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头 ⑵使用注意事项 未装吸头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。 一定要再允许范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。 不要横放带有残留液体吸头的移液器 不要用大量程的移液器移取小体积样品 微量移液器每日用完后，应旋转到最大刻度，让弹簧恢复原形，保持弹性。 为了确保微量移液器的准确性，移液器必须定期进行校准。 3. 琼脂糖凝胶制作 选择好胶盒、胶板和梳子，洗净，把胶板放入胶盒中，梳子插上。 量取25ml 1×TBE溶液放入锥形瓶或烧杯中 称量0.25g 琼脂糖，倒入锥形瓶中 将锥形瓶放入微波炉中，让溶液沸腾2-3次，琼脂糖彻底融化 锥形瓶取出，稍稍冷却后倒入胶盒中 等待琼脂糖冷却凝固形成点样孔后即可 生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。 消化缓冲液: TE ?、EDTA、 NaCl、 SDS、蛋白酶K Tris平衡酚、氯仿:异戊醇(24:1)，NaAc，无水乙醇，70%乙醇 １、切取组织 ，剪碎放入研钵(越细越好)，磨成粉末。以消化缓冲液处理55℃水浴过夜，获得组织消化液。 ２、取出消化组织液，5000rpm?，３min，取上清液于新离心管 。 ３、 加等体积Ｔris-平衡酚，轻轻混匀５min。 4、1000rpm，10min，留上清，取上清液于新离心管 。 ５、加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，轻轻混匀５min。 ６、同４。 ７、加等体积氯仿:异戊醇，轻轻混匀５min。 ８、同４。 ９、加?1/10?体积3mol/L?NaAc，及２.５?倍体积预冷（－２０℃）无水乙醇，混匀。 －２０℃ 沉淀３０min。 １０、12000rpm，15min，弃上清。 １１、加70%乙醇1ml，混匀。 １２、 同１０。 １３、ＥＰ管放置于烘箱中烘干。 １４、加３０ul TE或ddH2O溶解ＤＮＡ。 １５、琼脂糖凝胶电泳检测。 　　　提取染色体ＤＮＡ的基本原理是什么？操作中应该注意什么？ １、聚合酶链反应 (Polymerase chain reaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段的过程。 ２、ＰＣＲ反应体系 　　引物、dNTP、 Mg２＋ 、模板、 Taq DNA聚合酶， Buffer。 ３、ＰＣＲ循环参数 ① 9５℃ 5min ② 9５℃ 30s ③ 5２℃ 30s ④ 72℃ 30s ⑤ goto② ２９times ⑥ 72℃ 10min Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液， MgCl2，dNTP，引物，模板，d