基因工程的基本操作步骤-1.ppt

（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越 。 （3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是 。 （4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止 。 （5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 酶。 （6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 。 （7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在 的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。 高 SmaⅠ破坏质粒上的抗性基因和外源DNA中的目的基因 质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 DNA连接 鉴别和筛选含有目的基因的细胞 蔗糖为唯一含碳营养物质 * 1、基因工程包括哪些步骤？ 3、基因工程中的核心环节是哪一步？ 4、基因表达载体导入到受体细胞有哪些方法？ 5、目的基因导入受体细胞就会成功表达吗？ 如何检测和鉴定？ 2、什么是目的基因？获取的方法有哪些方法？ 思考讨论问题： 基因工程的基本操作程序 一、目的基因的获取 二、基因表达载体的构建 三、将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定 主要是指编码蛋白质的基因 (一）目的基因 　 目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。 一、目的基因的获取 （二）获取目的基因的方法 1、从基因文库中直接获取 2、PCR技术扩增 3、化学方法直接人工合成 1、从基因文库中直接获取 （1）基因文库的概念 部分基因文库： 基因组DNA文库： 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库 含有一种生物的全部基因 只包含了一种生物的部分基因，如:cDNA文库 （2）基因文库的建立方法 提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶酶切 一定大小的DNA片段 将DNA片段与运载体连接 导入受体菌中储存 基因组文库 方法一：直接分离法 某种生物的单链mRNA 单链互补DNA 双链cDNA片段 导入受体菌中储存 与运载体连接 cDNA文库 反（逆）转录酶 DNA聚合酶 方法二：反转录法--cDNA的合成流程图解 PCR技术—多聚酶链式反应 PCR扩增仪 DNA半保留复制的基本原理 一段已知目的基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 模板DNA 2、利用PCR技术扩增目的基因 原理： 前提： 条件： 利用PCR技术扩增目的基因 5’ 3’ G—G T—C 3’ 5’ A—G C—C 5’ 3’ 引物Ⅱ G—G 高温变性 低温退火 中温延伸 1.目的基因DNA受热变性，解链； 5’ 3’ A—G 引物Ⅰ 2.引物与单链互补结合； 3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 3、人工合成 —— 核心 二、基因表达载体的构建 功能：使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗传给后代。 基因表达载体的构建 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。 编码区 非编码区 非编码区 启动子 启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。 RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质. 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。 终止子 编码区 非编码区 非编码区 启动子 终止子 A G G T C A C G T C G T C C A G T G C A G C RNA聚合酶 A G G U C A C G U