基因工程的基本操作程序-1.ppt

复习 1.基因工程中基本工具有哪些？ 2.基本工具的作用和特点分别是什么？ 3.限制酶、DNA连接酶分别作用于DNA的什么部位？ 4.基因工程的基本步骤是什么？ 5.获得目的基因的方式有哪些？ 真核生物的基因结构 第二节基因工程的基本操作程序 cDNA文库 基因组文库 PCR的反应体系 模板：DNA 原料：四种 脱氧核苷酸； 酶：Taq酶（ TaqDNA聚合酶）嗜热细菌中分离得到 引物：DNA片段 Mg2+（维持酶活性所必需） PCR缓冲液：维持PH恒定，保护Taq酶 ㈡ PCR反应曲线 PCR的应用 PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。 实例 1： 1、下列获取目的基因的方法中需要模板链是（ ） A.从基因文库中获取目的基因 B.利用PCR技术扩增目的基因 C.反转录法 D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 基 因 枪 法：单子叶植物常用的一种基因转化方法，但成本较高。 将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ②程序： pBR322质粒结构 2.检测目的基因的表达 导入微生物细胞 将目的基因克隆到大肠 杆菌细胞中的操作步骤： 1)获得目的基因和质粒载体； 2)形成重组质粒； 3)制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞； 4)培养大肠杆菌，让重组质粒形成大量拷贝； 5)筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞。 导入植物细胞：土壤农杆菌转化法 土壤农杆菌：具有趋化性（酚），感染双子叶植物和裸子植物 花粉管通道法：十分简便经济的方法。我国的转基因抗虫棉就是用此方法获得。 重组DNA提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵发育 新性状动物 转基因动物 1.筛选含有目的基因的受体细胞 通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。 （1）抗药性筛选法： 菌株为某种抗生素缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如抗氨苄青霉素，抗卡拉霉素等）。如何筛选出含有目的基因的受体细胞？ （这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。） （四）目的基因的检测与鉴定 如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 标记基因 进行筛选 限制性内切酶 识别序列 外源基因连接 PStⅠ PStⅠ 自主复制 （2） DNA分子杂交——检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 ①首先取出转基因生物的基因组DNA ②用含目的基因的DNA片段（单链）用放射性同位素等作标记,以此做探针 ③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中 过程: 利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆 检测方法： DNA分子杂交技术 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 * 目的基因 1．质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点 是： ( ) ①能自主复制　 ②不能自主复制　 ③结构很小 ④蛋白质　 ⑤环状RNA　 ⑥环状DNA ⑦能“友好”地“借居” A．①③⑤⑦　B．②④⑥ C．①③⑥⑦　D．②③⑥⑦ C 2．下列不是基因载体必须具备的条件的是 ( ) A、能自我复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA D 编码区 非编码区 非编码区 与RNA聚合酶结合位点 前体信使RNA 成熟的信使RNA （一）获得目的基因 （二）构建基因表达载体——形成重组DNA分子 （三）将目的基因导入受体细胞 （四）目的基因的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序 用DNA合成仪人工合成 利用PCR技术扩增 已知序列： 从基因文库获得 未知序列： （一）目的基因的获取：目的基因即我们所需要的 基因。 基因组文库：含某种生物的全部基因 部分基因文库：含某种生物的部分基因 （如cDNA文库） 从基因文库中获取目的基因 鸟枪法：散弹射击法 供体细胞DNA 限制酶 许多DNA片段 载入 载 体 导入 受体细菌 扩增 产生特定性状 分离 目的基因 构建基因组文库并获得目的基因： 基因组D