生化分析考试要点生化分析考试要点.docx

层析法：利用混合样品中，不同物质在固定相和流动相中的分布程度不同而进行分离的方法称其为层析法（或色谱法）。特点：应用范围广；可对物质进行定量、定性和纯度鉴定；柱层析（column chromatography）将固定相装于柱内，使样品在层析柱中进行分离。纸层析（paper chromatography）用滤纸作液体的载体（担体support），点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析（thin layer chromatography）将适当粒度的吸附剂在玻璃板上铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定分配定律：分配系数K=试样在固定相中的浓度/试样在移动相中的浓度=CAS/CAM在定温、定压下，在一定的溶剂系统中，一定的物质其K值保持不变，不同的物质其K值不同当温度、压力或溶剂系统改变时，对于一定的物质来说，其K值也随之改变K值大于1，物质在S相中的浓度大于其在M相中的浓度，反之则小分配比率（容量因子） k’=化合物在固定相中的量/化合物在移动相中的量=p/q K=（p/Vs）/(q/Vm) （G=k’）=K Vs/Vm容量因子与溶剂系统的组成、体系的温度、压力有关，还与两相的体积比值有关理论塔板数N及理论塔板高度HETP=L（柱长）/N 影响因素 HETP=Cmd2u/Dm Cm溶质分子的浓度；d 固定相颗粒直径；u 流速；Dm溶质分子的扩散系数高流速可以高样品输出性和高产量；低流速可提高分辨率影响分离的因素：①洗脱曲线的参数②分离度Rs③分离系数α（代表了两个物质在相同的色谱条件下的分离选择性样品区带扩散的因素：柱内扩散（涡流扩散、纵向扩散、传质速率）、柱外扩散（样品、层析介质、装柱、层析条件、死体积）塔板理论：分配系数大的组分，每次达到平衡的时间长，从层析柱中后流出。一个层析柱的塔板数越多，分离次数越多，柱效越高理论塔板高度HETP=Cmd2u/Dm Cm 溶质分子的浓度 d 固定相颗粒直径 u 流速Dm溶质分子的扩散系数聚焦层析（chromatofocusing）它是根据蛋白质的等电点的差异与蛋白质的离子交换作用进行分离纯化的。适用于分离某些蛋白质分子量和极性方面的性质十分接近，而等电点有区别的物质特点：离容量大（能分离几百毫克蛋白质样品）辨率很高（有洗脱峰被聚焦效应浓缩，峰宽度可达0.04-0.05pH单位）；作简单（不需特殊的操作装置）从分离的蛋白质中去除多缓冲剂的方法：沉淀法。凝胶过滤法、亲和层析法、疏水层析法。亲和层析AC（Affinity Chromatography）：根据生物分子间亲和吸附和解吸的原理建立起来的色谱法，生物大分子的专业结合作用（抗原和抗体、酶和底物及辅酶、酶和抑制剂、激素和受体、外源凝集素和糖蛋白、RNA和其互补的DNA等）特点：①分离迅速、操作简便；②可一步纯化；③专一性强；④缺点是使用局限性大。必要条件：①合适的配体（配基、ligand）：亲和力大、具有解离平衡、与载体偶联不失活。（亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称为配基）配体的浓度：一般使用较高的固定化配体浓度；当配体亲和力高，且本身带电则固定化配体浓度须降低。②合适的载体（Matrix）：条）件（亲水、惰性、具有活化基团、大网孔、机械性能好适的吸附和洗脱条件。e.g.谷胱甘肽转硫酶的分离：固相载体：琼脂糖凝胶（Sepharose 4B），配基为酶的底物之一（还原型谷胱甘肽），条件：碱性凝胶层析GPC：是采用具有分子筛效应的多孔凝胶作为固定相，对分子大小及形状不同的物质进行分离的一种液相层析方法。大分子跑得快特点：备简单、操作方便分离的分子量范围广泛（10^2-10^7）；胶完全惰性，且亲水；脱条件温和；析后柱无需再生处理，可反复使用。分配系数Kd=凝胶内部溶质的浓度/凝胶外部溶质的浓度，0≤Kd≤1影响因素：①柱长（静水压：串联层析、循环层析）②凝胶颗粒大小③样品（体积、粘度）④洗脱溶液（水，缓冲溶液）葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶交联丙烯基葡聚糖凝胶离子交换sephadexSepharos200-800000，耐碱惰性，空较小，耐热，不耐酸惰性，大孔，50℃耐药高，不耐酸，容量大，耐高温容量大、网孔大脱盐、组别分离脱盐，组别分离大分子分离大分子分离受离子强度、pH影响体积变化大柱体积变化小，不耐高温离子交换层析IEC：在层析柱中，利用溶液中不同离子与某种离子交换剂的交换能力不同，因而在洗提过程中不同离子的移动速度不同，因而达到彼此分离的目的特点：分离效率高，适用性广，可再生，具有较好的重复性原理：离子交换剂的交换作用，离子交换介质的排斥和阻滞作用R-SO3- H+ + Na+ = R-SO3 Na + H+R-N(CH3)3 OH + Cl- = R-N(CH3)3