生化大实验指导书生化大实验指导书.doc

《生物化学大实验》 参考资料 《生物化学综合大实验》课程组 2014年12月 资料来源：1、张龙翔 张庭芳 李令媛1997年第2版 15% （分离胶） 4%（浓缩胶） 水 1.25ml 3ml 凝胶贮液 2.5ml 0.65ml 4X分离胶buffer 1.25ml 4X浓缩胶buffer 1.25ml Temed 5微升 5微升 10% 过硫酸铵 50微升 50微升 总体积各为5ml，根据需要可调整。 首先配置分离胶，用异丙醇封胶，待胶凝固后，用水把异丙醇洗掉，然后配置浓缩胶，插入梳子，等待凝固。 思考题 1、为什么SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法可以测定蛋白质的分子量？ 2、在用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，应注意哪些问题？ 实验二 血红蛋白凝胶过滤层析 【实验目的】 通过本实验学习凝胶过滤层析的操作技术，掌握凝胶过滤层析的原理及其应用。 【实验原理】 凝胶过滤（gel filtration）（molecularsieve chromatography）（exclusion chromatography） 1．凝胶介质 目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4 大类，即葡聚糖凝胶，商品名（ Sephardex）（Sepharose）（bio-gel ）-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。它们都是不溶于水的高聚物，内部有很微细的多孔网状结构。以Sephardex 为例，它是由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物，网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大，则交联度越大，凝胶的网眼越小。Sephadex 有很强的亲水性，在水或缓冲液中能吸水膨胀。交联度越大，网眼越小，吸水量也越少。实际工作中常用每克干胶吸水量（mL）10倍（G值）表示葡聚糖凝胶的交联度，可根据被分离物质分子的大小和工作目的，选择适合的凝胶型号。 2．凝胶过滤的原理 凝胶过滤层析（凝胶过滤）是把样品加到充满凝胶颗粒的层析柱中，然后选择适当的缓冲液进行洗脱。凝胶本身是一种分子筛，凝胶颗粒有一定得孔径，它可以把待分离样品按分子大小不同进行分离，好像过筛，可以把大颗粒与小颗粒分开。但这种过筛与普通的筛子不同。凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。 将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使其充分吸收膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，然后再用同一溶剂洗脱，在洗脱过程中颗粒直径接近或大于凝胶颗粒网孔直径的大分子，不能进入凝胶颗粒中的静止相，只能留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此先流出层析柱；反之，小分子则可自由出入凝胶颗粒，因而流速慢以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4 溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2 结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。 3．凝胶过滤的优点及用途 凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物；凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因而溶质回收率接近100%；而且设备简单、操作方便、分离效果好、重现性强，凝胶柱可反复使用。所以，凝胶过滤常用于测定相对分子质量、脱盐、蛋白质等大分子的分离纯化。 【实验仪器及试剂】 1．仪器： 层析柱（Ф1cm x 0cm） 2．试剂： （1）磷酸缓冲液（PH 7.0）Na2HPO4·2H2O 2.172g，NaH2PO4·2H2O 1.076g1000mL。 （2）Na2HPO4－EDTA－Na2 2.69g EDTA－Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O100mL。 （3）40m mol/L FeSO4 溶液:称取FeSO4·7H2O 1.11g 溶于100mL水中（用时现配）。 （4）Sephadex G－255）固体铁氰化钾〔K3Fe（CN）6〕 6）抗凝血（哺乳动物血样，以1：6的比例加入2.5%柠檬酸钠，置于4℃冰箱中保存）。 【实验步骤】 1．凝胶溶胀： 取10g SePhadex G－25200mL蒸馏水充分溶胀（在室温下约需6小时或在沸水浴中溶胀5小时）。待凝胶溶胀平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，再加入与凝胶等体积的pH 7.0磷酸缓冲液，在真空干燥器中减压除气，准备装柱。 2．装柱： 将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，在柱内加入少量磷酸缓冲液或直接把处理好的凝胶连同适当体积的缓冲液用玻棒搅匀，然后边搅拌