生化试验大纲ZZ生化试验大纲ZZ.doc

题型名解 问答 计算，名解考书上有的，最好看一下ppt，蓝白筛的以ppt为主，问答考原理，步骤 大纲，实验设计（如克隆胰岛素基因怎么做），计算考蛋白质浓度计算，lamber-Beer定律（注意稀释倍数），酶动力学分析的km值和双导数法，酶切实验酶切带大小 (一)目的要求： 掌握：分光光度法的基本原理及波长的选择；利用标准管法计算待测溶液的浓度；离心原理 熟悉：生物化学与分子生物学实验基本操作：常用玻璃仪器的洗涤、干燥的使用及移液器；7220型分光光度计；台式离心机的使用 了解：生物化学与分子生物学实验须知及安全措施 （二）学时安排：1学时 （三）教学内容： 1.关键词： 分光光度法：根据物质对光的吸收特性和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法 摩尔消光系数：指在一定波长下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度。 百分消光系数：指在一定波长下，C=1g/100ml,L=1cm时的吸光度。 标准曲线：又称校正曲线或工作曲线，是比色分析法中不可缺少的步骤，从浓度-光密度值直线的直线特性，可判断所采用方法的成色反应是否符合Lambert-Beer定律 Lambert-Beer定律： Lambert-Beer 定律是说明物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度（C）和 液层厚度（l）间的关系的定律，是光吸收的基本定律，是紫外-可见光度法定量的基础。 ? 实验一?蛋白质定量分析技术 (一)目的要求： 掌握：几种测定蛋白质浓度的原理和方法、优缺点及操作注意事项；标准曲线的绘制；利用标准曲线或者吸光系数（消光系数）进行换算，求待测溶液的浓度 熟悉：标准曲线的作用。 (二）学时安排：5学时 (三）教学内容： 1.关键词： 双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应 2.主要教学内容： （1）双缩脲法： ·原理：蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中能与Cu2+反应生成紫红色化合物，在1-10mg/ml的范围内，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 ·优点：操作简便、迅速，受蛋白质种类性质的影响较小 ·缺点;灵敏度差，特异性不高，除与-CONH-由此反应外，还与-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团有此反应。 ·试剂：蛋白质标准液、待测血清样本、生理盐水、双缩脲试剂 紫外分光光度法： ·原理：蛋白质分子中含共轭双键的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，其吸收高峰在280nm处，但核酸在280nm处也有一定吸收能力，其吸收峰最大值在260nm处，经经验公式校正，可推算出蛋白质的真实含量。 ·优点：操作简便、迅速，蛋白质不损失，可回收 ·缺点;结果不准确，仅可作为粗略的测定方式 ·试剂：血清样本、生理盐水 BCA法： ·原理：碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合两个BCA分子，试剂从原来的苹果绿变成紫色复合物，在一定范围内，颜色深浅与蛋白质成正比。 ·优点：操作简便、快速，灵敏度高，准确，试剂稳定，经济实用，抗干扰能力强。 ·缺点：反应时间长且蛋白质也会发生不可逆的变性。 （一）目的要求： 掌握：米氏常数测定的原理和方法；碱性磷酸酶活性的测定方法和注意事项；可逆抑制剂类型中，抑制剂、底物、酶三者的相互关系及测定方法 熟悉：底物浓度曲线（双矩形曲线）和双倒数曲线的作图方法及利用图解法求得Km值和Vmax值；验证抑制作用的类型，并计算Ki值 （二）学时安排：5学时 （三）教学内容： 1.关键词：酶促反应动力学：研究各种因素对酶促反应速率的影响，并加以定量的阐述。 米曼氏方程：表示酶促反应中反应速率与底物浓度关系的数学方程式。 Km：酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度 竞争性抑制：有些抑制剂与底物结构相似或部分相似，可与底物共同竞争与酶的活性中心结合而抑制酶的活性，表现竞争性抑制作用，该种抑制方式称为竞争性抑制，为可逆性抑制。 双倒数作图法：即林-贝氏作图法，为求得Vmax和Km的最常用方法，即将米曼氏方程的两边同时取倒数，并加以整理，即得出一线性方程式，以1/V对1/S作图得纵轴截距为1/Vmax，而横轴截距为-1/Km的直线 2.主要教学内容： （1）米氏常数测定的原理：在酶促反应中，当反应体系的温度、 pH及酶浓度恒定时，底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系，AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用，经铁氰化钾氧化，可生成红色的醌衍生物。；碱性磷酸酶活性的测定方法：1.各管底物、缓冲液、蒸馏水配比好，37℃水浴保温5min 2.加入酶液，混匀后置于37℃水浴准确保温15min，保温后立即加入碱性溶液终止反应。3.各管加入4-氨基安替吡啉和铁氰化钾，混匀静置，以空白管调零，于波长λ处比色，测定各管吸光度。和注