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生物化学复习知识点概括 B6 蛋白质的纯化（purification） 蛋白质的稳定作用（stabilization） 1.选择适当的缓冲液（PH=7）； 2.操作温度：4℃； 避免蛋白质变性和降解 3.添加蛋白酶抑制剂 二、硫酸铵沉淀法蛋白质混合物的分级分离 加入硫酸铵盐离心 弃去上清液，重新再溶解蛋白 通过透析脱盐 结果：目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离。 【盐析利用蛋白质的性质：溶解度】 透析（dialysis） 1.蛋白质是高分子化合物，不易透过半透膜，因此可用透析法纯化蛋白质，主要应用是脱盐 (de-salting)。 2.半透膜上的孔允许约10kDa以下分子通过，大多数蛋白质的分子质量超过了10kDa，故会留在透析袋内。 【到达平衡时，透析袋内的小分子浓度相同，故此需要多次更换周围的溶液有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度】 凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography) 1.原理: 柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒(porous gel beads),具有一定的孔径;将蛋白质溶液加到柱子上端,并使一定缓冲液(buffer,即流动相)不断流过柱子, 则大分子不能进入凝胶颗粒先被洗脱(eluted),而小分子进入凝胶颗粒,后被洗脱,因此,不同分子是基于它们的大小不同而被分离的。 （1）多孔凝胶颗粒(不溶的、高度亲水的)。 （2）Elution volume (Ve)(洗脱体积) 从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积。 （3）Void volume (Vo) (空体积) 柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩余体积。 （相对洗脱体积(Ve/Vo)与分子量的对数呈线性关系） 主要应用: 样品的脱盐 、蛋白质分子量的估计 离子交换层析(Ion exchange chromatography） 1.原理:柱子中的固定相为带正电荷(positively charged)或负电荷(negatively charged)的颗粒(又称为离子交换剂 ion exchanger),在一定pH值下各种蛋白质所带净电荷不同,与离子交换剂的作用方式和强弱也不同,可通过一定方式被先后洗脱下来,因此,不同分子是基于它们所带的净电荷(on the basis of their net charge)差异而被分离的。 （1）阴离子交换剂(自身带正电),用于阴离子交换层析中,可吸附并分离带负电的蛋白质 (阴离子) （2）阳离子交换剂(自身带负电),用于阳离子交换层析中,可吸附并分离带正电的蛋白质 (阳离子) 亲和层析（Affinity chromatography） 1.原理: 利用蛋白质与另一种分子(它的配体)的特异性结合的性质进行分离。如酶与其抑制剂或辅酶, 抗体与抗原,受体与激素等。 2.过程: 配体(ligand)固定在不溶性支持物上并装入柱中, 混合蛋白通过亲和柱时, 其它蛋白全流过, 只有目标蛋白结合在固定化的配体上,使用缓冲液对柱子进行冲洗，最后加入含可溶性配体的缓冲液可将目标蛋白以高纯度的形式洗脱下来。随后再透析除去小分子配体。 B7 蛋白质的电泳（electrophoresis） 电泳（electrophoresis） 定义：带净电荷的分子在电场中向一极或另一极移动的现象。 净电荷越大，分子移动越快。 原理：根据蛋白质的净负电荷和分子大小在电场中进行分离。小的带负电荷较多的蛋白质比较大的带负电荷较少的蛋白质在凝胶中迁移得快。 SDS（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳） 1.原理：用还原剂处理样品，使二硫键打开,同时用阴离子去污剂SDS使蛋白质变性，并使蛋白质覆盖负电荷,然后进行电泳。由于所有蛋白质都带与其质量成正比的负电荷，所以是根据它们的质量而被分离。小分子迁移快，大分子慢。 2.特点：快速、灵敏、广泛使用 3.应用：测定蛋白质样品的纯度；估计未知蛋白质的分子质量；推测某种蛋白多肽亚基数目。 C4 酶的抑制作用（ Enzyme Inhibition） 酶的抑制作用（ Enzyme Inhibition） 抑制剂（Inhibitors）：直接作用于酶并使它的催化速率降低的分子。包括正常机体代谢物、药物和毒物。 2.酶的抑制作用类型：可逆的和不可逆的。可逆性抑制可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。 不可逆性抑制 定义：抑制剂不可逆地与酶结合，它通常与活性部位或其附近的氨基酸残疾形成共价键，永久使酶失活。 可逆的竞争性抑制 1.典型的竞争性抑制剂与酶的正常底物有相似的结构