生物工艺学实验生物工艺学实验.doc

生物工艺学实验 实验指导 （适用生物工程专业） 屈慧鸽 冯志彬 程仕伟编写 鲁东大学生命科学学院 实验一 呼吸缺陷型酵母菌株的诱变选育 一、实验目的 1、理解呼吸缺陷性酵母的筛选原理； 2、掌握呼吸缺陷性酵母的筛选步骤。 二、实验原理 部分酵母菌在一定的物理（如紫外线）或化学诱变剂作用下发生基因突变而丧失呼吸能力，呼吸缺陷性酵母菌株即为丧失呼吸能力的突变株，其对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，但CO2放出高于对照株，酒精脱氢酶活力也较对照高出1倍左右，对提高酒精产率有好处。同时，呼吸缺陷型也是育种工作可利用的一个有效的遗传标记。 三、实验材料 1.菌株：酒精酵母 2.培养基 CM培养基： 葡萄糖 40g MgSO4 2g 蛋白胨 10g 琼脂 18g 酵母膏 5g 水 1000ml KH2PO4 5g 不加琼脂即为液体CM，分装20ml于250ml三角瓶中。 TTC上层培养基 葡萄糖 5g TTC（红氮四唑） 0.5 g 琼脂 10g 水 1000ml 分装，121℃灭菌 15min。 TTC下层培养基 葡萄糖 10g MgSO4 (7H2O 0.4g 蛋白胨 2 g 琼脂 18 g 酵母膏 5 g 水 1000 ml KH2PO4 1 g pH 5.5～5.7 MM甘培养基 酵母膏 6.7 g 甘油 20 ml 水 980 ml pH 5.5 琼脂粉 18 g 分装，121℃灭菌 10min。 3、仪器设备 紫外诱变箱、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱 四、操作步骤 1、培养基配制：配制实验过程中所需全部培养基并准备诱变及筛选所需的移液管、试管、平板等物品，121℃灭菌20min，其中TTC上层板培养基灭菌后备用，无需倒平板； 2、菌种活化：取活化后的酵母菌1环，接入到三角瓶中液体CM培养基，200r/min、30℃振荡培养过夜； 3、菌悬液制备：将培养好的酵母细胞4000r/min离心洗涤3次，调整细胞浓度为106/ml备用，实验过程无菌操作； 4、诱变：取15-20ml菌悬液于灭菌空白平板内，磁力搅拌器转速为30r/min，调整与紫外灯管距离为20cm，开盖照射45-75s，盖上盖诱变结束； 5、稀释涂布：将诱变后的菌悬液梯度稀释至10-6，于CM平板涂布，避光培养24-36h，选择菌落个数合适的平板备用； 6、点接：将CM培养基平板上长出的菌落点种 TTC下层平板上，30℃培养24-48h； 7、鉴定：将TTC上层培养基溶化并冷却（不烫手）后，小心倾入TTC上层培养基上，使其刚好掩埋菌落。等凝固后，30℃培养2～3h。此时，平板菌落颜色会区分成红色、粉红色和白色。呼吸缺陷型突变株为白色菌落。 8、复检：用无菌牙签将在TTC鉴别培养基上生长的白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上。注意点种时，先点MM甘培养基，后点种CM培养基，并在平皿上做好标记。30℃培养24h观察实验结果。 五、实验结果分析 1、描述实验结果计算呼吸缺陷性酵母突变率，并分析实验过程中影响诱变效果的因素； 2、对比并参照其他小组实验结果，评价本小组实验过程中的利害得失 六、数据分析 突变率：平板计数法 七、思考题 1、分析呼吸缺陷型突变株为白色菌落为白色，其它菌株红色、粉红色的机理。 2、呼吸缺陷性酵母筛选工作有何现实意义？ 3、如果白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上培养后都有生长，讨论有哪些原因？ 实验二 红曲发酵及红曲色素的提取 一、实验目的 1、了解红曲菌液体菌种的制备方法, 为红曲发酵实验准备液体种子。 2、了解固体发酵的工艺过程 , 在实验室中小规模制备红曲。 3、熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价的测定方法。 二、实验原理 红曲霉菌属真菌界(Eumycophyta)、子囊菌门(Ascomycota)、真子囊菌纲(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)、红曲菌属(Monascus)。由红曲霉接种于大米发酵得到的红曲是我国古代的一大发明，称为丹曲，至今已有1000多年的历史，很早就应用于食品着色、食品发